流式细胞术的学习（七）-补偿调节

虎威将军

原理：流式荧光素在相应激光激发后发射的荧光波长并不是完全集中于一个很小的范围。
调节补偿如何实现：为了让FL1代表FITC荧光素的荧光信号，FL2代表PE荧光素的荧光信号，而不是FL1和FL2的荧光信号是由一定比例的FITC荧光信号和PE荧光信号共同组成，排除FL2中来自于FITC的荧光信号，就是设置“FL2-FL1”（“PE-FITC”）的补偿值，使FL2完全代表PE的荧光信号；排除FL1中来自于PE的荧光信号，即设置FL1-FL2”（“FITC-PE”）的补偿值，使FL1完全代表FITC的荧光信号。
要求：第一如需要调节FL1和FL2之间的补偿，需要选择两种荧光素偶联抗体，其中一个抗体偶联的是FITC荧光素，另一个抗体偶联的是PE荧光素；第二是选择的两个抗体所结合的抗原分子必须在样品细胞中有明确的表达，并且表达该抗原的细胞占有较高的比例，如果阳性细胞比例太低，在阳性细胞区域就无法形成明显的细胞团，从而无法判断补偿调节是否得当。表达的比例也不应太高，一般不宜超过50%，这样不表达该抗原分子的细胞的荧光信号可以作为硬性对照。
根据实验目的确定是否需要补偿调节，对于单色分析标记一种荧光素偶联抗体时，就不需要补偿调节单色分析FITC通道；对于双色分析，一般采用FITC通道和PE通道，同时标记FITC和PE偶联的抗体，这两个通道之间就需要调节补偿；双色分析不能满足试验需求，就需要进行三色分析。
一般相邻的荧光通道之间需要调节补偿，相隔的荧光通道之间因为各自接收的波长范围相差较大，一般不需要调节补偿。
影响补偿大小的因素：仪器型号、荧光素偶联抗体、细胞。
荧光通道之间的补偿并没有一个固定的值，不同型号的仪器具有不同的补偿值大小，不能将一台仪器的补偿值直接应用到另一台仪器上，但不同型号仪器之间的荧光通道补偿值相差不多，一般都在一定的范围内。
由于荧光素发射的荧光波长不是绝对的集中，所有需要调节补偿。如果荧光素发射的荧光信号被相邻通道接收的比例越高，则需要调节的补偿值就相应较大。
当细胞的理化性质相差较大时，标记相同的荧光素偶联抗体，使用相同的通道时，各通道之间的补偿可能不同。

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