分子互作大比拼，SPR、ITC、MST、BLI，谁才是最强王者？| MedChemExpress (MCE)

奋斗的小鸟

在生命的舞台上，蛋白质在“交谈”，DNA 在“舞动”，而小分子则是热情的“伴舞者”。关于分子互作检测技术你了解哪些呢？快和小 M 一起了解下~

分子之间的相互作用不仅决定了生物体的基本功能，还在细胞信号传导、基因表达以及疾病发生发展等过程中扮演关键的角色。为了深入了解这些复杂的生物网络，科学家们开发了多种分子互作检测技术，如表面等离子共振技术 (SPR)、微量热泳动 (MST)、等温滴定量热法 (ITC) 和生物膜干涉技术 (BLI) 等。

4 种技术比较及选择建议“省流版”汇总如下：

表 1. 四种分子互作检测技术的区别

   表格看不过瘾？且看下文深入了解生物分子互作检测技术~~              
<hr/>01 表面等离子体共振 (SPR)

表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）是一种高灵敏度的生物传感技术，通过监测生物分子在金属薄膜表面的相互作用，实时、无标记地提供结合动力学和亲和力数据，广泛应用于分子互作检测。
SPR 技术的核心是利用光在不同介质中产生消逝波后与金属表面的等离子波产生共振，当固定在芯片上的配体和流经芯片的分析物发生结合和解离时，芯片表面质量变化造成共振角发生变化，传感图会实时记录相互作用下的信号值，根据此变化曲线从而得出分子间相互作用的解离常数 (KD)、结合速率常数 (Ka) 和解离速率常数 (Kd) (图 1)。




图 1. 表面等离子共振技术 (SPR) 的基本原理。

SPR 筛选、验证高亲和力 SOAT1 配体，重塑胆固醇代谢，抑制肿瘤生长


“High-affinity SOAT1 ligands remodeled cholesterol metabolism program to inhibit tumor growth”一文筛选出了三种与 SOAT1 结合最佳的化合物，Nilotinib、ABT-737 和 Evacetrapib。特别是，Nilotinib 对 SOAT1 蛋白显示出高亲和力，并在体外和体内显著抑制了肿瘤活性[1]。
作者首先利用虚拟筛选得到了评分靠前的 62 个化合物，然后通过 SPR 单浓度筛选验证了其中的 33 个，有 10 种化合物的响应值 (RU)>10。最终，得到了 Nilotinib，ABT-737 和 Evacetrapib 三种化合物与 SOAT1 的 SPR 亲和力测定结果，其 KD 值分别为 2.02E−07 M，7.19E−07 M 和 3.91E−06 M，表明 SOAT1 和 3 种化合物均有很强的亲和力 (见图 2)。




图 2. 基于 SOAT1 蛋白的药物筛选[1]。  a. 基于结构的 SOAT1 蛋白虚拟筛选产生了 62 种潜在化合物（橙色）。b. 筛选出的 Nilotinib 与阳性对照 Nevanimibe 均结合在 SOAT1 的催化位点。c. 通过表面等离子体共振（SPR）对 SOAT1 蛋白进行药物筛选的示意图。d. SPR 验证 SOAT1 的已知共晶配体（nevanimi



SPR 评估肝素、NAH 与 HMGB1 蛋白的结合特性


肝素主要通过肝素酶和 HMGB1 两个作用靶标来阻断 LPS 的胞浆内转运，从而抑制 Caspase-11 的活化。“Heparin prevents caspase-11-dependent septic lethality independent of anticoagulant properties”一文阐述了肝素在脓毒症中能有效阻断 Caspase-11 介导的免疫反应、脏器损伤和死亡，为今后脓毒症的防治提供了新的思路[2]。
作者首先通过常规 SPR 分析，证实肝素和 NAH 可以直接结合 HMGB1，KD 值分别为 5.59E−06 M，2.27E−04 M (图 3)。随后，SPR 竞争分析结果表明，肝素和 NAH 均能抑制 HMGB1 与 LPS 的结合 (图 3)。




图 3.  常规 SPR 分析与竞争 SPR 分析结果[2]。  a. SPR 检测肝素和 NAH 与 HMGB1 的结合。b. 肝素和 NAH 抑制 HMGB1-LPS 的结合。




02 微量热泳动 (MST)     

微量热泳动 (Microscale Thermophoresis, MST) 是一种基于检测在温度梯度中的生物分子电泳迁移率变化的技术，通过精确检测荧光变化，结合灵敏的热泳动现象，定量分析分子间相互作用。
MST 技术的核心是利用激光在样品溶液中产生一个局部的温度梯度，不同的分子在温度梯度中的迁移行为不同，迁移的程度与其质量、带电性以及分子间的相互作用力密切相关，这种迁移可以通过荧光标记的分子或天然荧光分子的荧光信号变化来检测，从而获得分子间结合亲和力常数 (KD) (图 4)。



图 4. 微量热泳动技术（MST）的基本原理[3]。 MST 的设置和实验。a. 下方显示了一个可以容纳 16 根毛细血管的毛细管托盘。b. MST 光学原理图。c. MST 实验的典型信号。d. 典型结合实验。  

MST 助力抗抑郁药物的发现


      “Antidepressant drugs act by directly binding to TRKB neurotrophin receptors”一文中，作者发现了抗抑郁药物可以直接与 BDNF 的受体 TrkB 结合，提高 TrkB 在膜表面的表达量从而增强 BDNF 的信号通路，得以解释抗抑郁药的细胞生物学和行为学作用[4]。
作者通过 MST 实验验证了抗抑郁药氟西汀 (FLX) 和在 HEK293T 细胞裂解液中用 GFP 标记的 TRKB 可以直接结合 (图 5)，并通过分子建模进一步证明了这种抗抑郁药可以与 TrkB 二聚体结合，增加了它们在突触细胞膜 (富含胆固醇的膜区) 中的数量，最终增强 BDNF 的信号传导。




图 5. MST 检测 FLX 和 TRKB 的结合[4]。


03 等温滴定量热法 (ITC)

等温滴定量热法 (Isothermal Titration Calorimetry, ITC) 是一种通过监测分子结合时所释放或吸收的热量变化来进行分子互作检测的一项技术，提供亲和力和热力学信息，帮助我们更深入的理解生物分子互作的机制。 ITC 的核心是基于量热法的原理，将配体 (如小分子药物) 通过滴定针以小体积逐步滴入放置于滴定池中的目标分子 (如蛋白质、核酸等)，如果两种物质之间存在特异性结合，则会发生放热或吸热现象，这种能量变化会被高灵敏度的量热仪捕捉并记录下来。根据反应过程的量热曲线，可以获取结合相关的亲和力常数 (KD)、化学结合计量比 (n)、焓变 (ΔH) 和熵变 (ΔS) 等信息 (图 6)。




图 6. 等温滴定量热法 (ITC) 的基本原理[5]。

SPR、ITC 双重验证毛兰素双靶向抑制 CRAF 和 MEK1/2

      “Erianin suppresses constitutive activation of MAPK signaling pathway by inhibition of CRAF and MEK1/2”一文阐述了天然产物毛兰素 (Erianin) 通过抑制 CRAF 和 MEK1/2 从而抑制 MAPK 信号通路的结构性激活，并在体外和体内显示了对各种 BRAF V600E 或 KRAS 突变癌症的活性，如黑色素瘤和结直肠癌[6]。
作者通过表型实验筛选了 4 个天然化合物，其中毛兰素具有较强的抗肿瘤作用，通过 Kinase Profiler™ 酶谱分析后，发现毛兰素抑制了 CRAF 和 MEK2 的激酶活性。为了证明毛兰素与靶标的亲和力，作者采用 ITC 技术和 SPR 实验进行验证，发现毛兰素和 MEK1/2 或 CRAF 之间具有很强的亲和力 (图 7)。      



图 7. Erianin 直接结合 CRAF 和 MEK1/2[6]。a. Erianin 与 MEK1、MEK2 和 CRAF（306-end）的 ITC 测定。b. 不同浓度梯度的 Erianin 与MEK1、MEK2 和 CRAF（306-end）的 SPR 测定。

<hr/>04 生物膜干涉技术 (BLI)

生物膜干涉技术 (Bio-Layer Interferometry, BLI) 是一种高灵敏度的光学传感技术，用于实时监测分子间的相互作用，广泛应用于生物医学和生物技术研究中。
BLI 技术的核心在于使用光纤生物传感器，当固定在生物传感器尖端表面上的配体和溶液中的分析物相结合时会引起传感器末端分子量的改变，从而导致生物膜厚度的改变，仪器便会实时地检测到干涉光谱的位移。通过监测这些变化，获取分子间相互作用的解离常数（KD)、结合速率常数 (Ka) 和解离速率常数 (Kd) (图 8)。




图 8. 生物膜干涉技术（BLI）的基本原理[7]。


BLI 反向垂钓—赋能靶点发现

     “Discovery of drug targets based on traditional Chinese medicine microspheres (TCM-MPs) fishing strategy combined with bio-layer interferometry (BLI) technology”一文[8]，开发的 TCM-MPs 靶向捕捞策略结合 BLI 反向垂钓技术，从复杂的靶蛋白系统中筛选出与活性成分直接相互作用的关键蛋白。
作者以参芪降糖颗粒 (SJG) 为例，构建 TCM-MPs，从人肾小球系膜细胞 (HMCs) 裂解物中筛选出 28 个差异蛋白，选择 GNAS 作为关键靶点。然后利用基于 BLI 和 UHPLC-Q/TOF-MS/MS 的反向垂钓技术，进一步筛选出可能与 GNAS 存在直接相互作用的 26 个小分子，其中 7 个被发现具有较强的结合活性 (图 9)，而这 7 个小分子也是 SJG 的主要成分。      



图 9. 通过 BLI 验证与 GNAS 相互作用的活性小分子[8]。

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<hr/>参考文献

[1] Wang Z.H, et al. High-afnity SOAT1 ligands remodeled cholesterol metabolism program to inhibit tumor growth. BMC Medicine. 2022 Aug 9;20(1):292.
[2] Tang Y.T, et al. Heparin prevents caspase-11-dependent septic lethality independent of anticoagulant properties. Immunity. 2021 Mar 9;54(3):454-467.e6.
[3] Jerabek-Willemsen M, et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 2014 Dec 5;1077:101-113.
[4] Casarotto P.C, et al. Antidepressant drugs act by directly binding to TRKB neurotrophin receptors. Cell. 2021 Mar 4;184(5):1299–1313.e19.
[5] Song C.C, et al. Choosing a suitable method for the identification of replication origins in microbial genomes. Front Microbiol. 2015 Sep 30;6:1049.
[6] Wang P.L, et al. Erianin suppresses constitutive activation of MAPK signaling pathway by inhibition of CRAF and MEK1/2. Signal Transduct Target Ther. 2023 Mar 6;8(1):96.
[7] Concepcion J, et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 2009,12:791-800.

[8] Zhang H, et al. Discovery of drug targets based on traditional Chinese medicine microspheres (TCM-MPs) fishing strategy combined with bio-layer interferometry (BLI) technology. Anal Chim Acta. 2024 May 29; 1305:342542.      

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