实验指南|Western Blot常见问题解答

Rose

Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。然而在实验过程中常常遇到很多问题。
不知道怎么选内参？目的蛋白信号弱？条带总是晕染不清晰？背景脏、非特异条带多、转膜效率低……？辛辛苦苦做了几天实验，显影结果一看，立马哭晕在厕所？
Protocol那么多，然鹅，没有一款是适合自己的？Western Blot总是做不好，怎么破？
本期将特别针对这些问题，给大家做一下解答。
问题1： 为什么选择内参？
内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有α-Tublin ，β-actin ，GAPDH 等，在Western Blotting 中使用内参其实就是在WB 过程中的另外用内参对应的抗体检测内参。其作用有二：
1.是看提取蛋白质量的好坏。
如果做western 的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。
2.是比较客观的说明目的蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。
不同的样品之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照，比较不同样品之间的表达情况。

问题2：为什么检测的背景比较高？
1.可能抗体浓度浓度较高。
2.抗原量较大。
3.一张膜中有的目的条带较弱，为了能让较弱条带显示出来，曝光时间较长。


问题3：为什么检测无信号？（白板）
大概总结为以下几类原因：
1.样品中目的蛋白丰度很低，低于实验的检测下限。
3.蛋白降解。
4.待测样品的确为阴性。
5.一抗失效。
6.抗原量不足，每泳道蛋白上样量不低于0.1ug。
问题4：为什么检测的结果分子量大小与实际不符？
1.翻译后修饰-比如蛋白的磷酸化，糖基化等，这些都会增加蛋白的分子量大小。
2.翻译后剪切-比如很多蛋白首先被合成为前体形式，然后通过剪切获得生物学活性。
3.剪切变异体-相同的基因，经过选择性剪接会产生不同分子量大小的蛋白。
4.相对电荷-氨基酸的组成（带电vs不带电）。
5.多聚体-比如蛋白二聚体。
问题5：为什么WB结果与QPCR结果趋势不一致？
这种情况我们也遇到过，比较正常的，WB反映的是蛋白水平的结果，qpcr反映的是基因水平的结果。理论上蛋白水平与基因水平是一致的，但是mRNA的高低不代表其表达蛋白的高低。
也有一些基因可能在组织样品中没有正常翻译，这样即使qpcr检测结果有表达，但是若蛋白没有正常翻译的话，WB则检测不到目的条带。
问题6：Western blot对于抗体选择一般是单抗好还是多抗好？
一般而言，单抗的特异性好，杂带少；多抗相对单抗易出条带，但特异性较差，可能会出现高背景和多带的现象。
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