protocol 分享｜免疫荧光技术

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简介
免疫荧光技术是指将抗原抗体反应和荧光标记技术联合使用以鉴定阳性杂交瘤细胞株的方法。
原理
根据抗原抗体反应的原理，先固定表达抗原的细胞，而后加入杂交瘤上清液（一抗），最后加入 FITC-二抗检查细胞内外是否有单克隆抗体结合。
若为阳性杂交瘤细胞株，则可在细胞上形成具有荧光素的抗原抗体复合物。荧光素受激发光照射会发出明亮的荧光，用荧光显微镜观察可以看到是否有荧光存在以及荧光强度，从而确定杂交瘤细胞株是否为阳性，并进行定量。
用途
阳性杂交瘤细胞株筛选等。
材料与仪器
仪器：荧光显微镜、移液器；
试剂：1×PBS、Tris-HCl 缓冲液、50 mM 氯化铵（用 PBS 配制）、含 1% BSA 的 PBS 溶液（简称封闭液）、细胞、90% 甘油（用 Tris-HCl 缓冲液配制）、透明指甲油、4% 的多聚甲醛（用 PBS 配制，PH 7.4）、一抗（纯化的单克隆抗体或杂交瘤细胞上清液）、二抗（FITC-抗鼠 IgG+IgM）、Triton X-100；
耗材：Lab-Tek II 腔室载玻片系统或 96 孔板、滤纸、移液枪头、离心管。
步骤
使用免疫荧光技术筛选阳性杂交瘤细胞株的步骤如下：
1、在腔室载玻片上或 96 孔板中培养细胞至合适的密度（约 60%~80%），弃去上清液，每个腔室或培养孔中加入 1×PBS 溶液润洗 2 次。
2、弃去 PBS 溶液，加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定细胞，室温下孵育 15~30 min。
3、弃去固定液，用含 50 mM 氯化铵的 PBS 溶液润洗细胞 3 次。
4、弃去氯化铵溶液，用 1×PBS 溶液润洗细胞两次。
5、弃去 PBS 溶液，加入冰上预冷的含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液，完全浸没细胞。置于 20 ℃ 中孵育 3 min。
6、去除液体，用 1×PBS 溶液润洗细胞 3 次，每次 5 分钟。
7、弃去 PBS 溶液，加入含 1% BSA 的 PBS 溶液封闭 30 min。
8、弃去封闭液，加入用封闭液稀释的一抗，没过载玻片即可。室温下湿盒中孵育 1 小时，或 4 ℃ 孵育过夜。
9、弃去一抗，用 1×PBS 润洗 3 次，每次 5 分钟。
10、加入二抗（FITC-抗鼠 IgG+IgM，用封闭液 1:100 稀释），在室温下避光孵育 1 小时。
11、弃去二抗，用 1×PBS 润洗 3 次，每次 5 分钟。
12、弃去 PBS，加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定尚未被固定的细胞，室温下孵育 15~30 min。
13、用蒸馏 H2O 润洗细胞。
14、若用 96 孔板，直接在显微镜下观察即可，观察完丢弃即可；若用 Lab-Tek II 腔室载玻片系统，则将载玻片夹在两片滤纸中间，温和地吸去多余的水分。
15、在载玻片上滴加一滴含 90% 甘油的 Tris-HCl 溶液，盖上盖玻片。在盖玻片边缘涂上一层透明指甲油起到密封的作用。
16、在荧光显微镜下观察，观察完的载玻片可以平放在不透光的玻片盒中，于 4 ℃ 或 20 ℃ 保存。
注意事项
1. Lab-Tek II 腔室载玻片系统相较 96 孔板更为优越，在前期实验中，每个腔室彼此分隔，可以同时检测不同的杂交瘤细胞株，后续又可以取下隔板，一次操作，搞定所有细胞株，相较 96 孔板操作更简单。
2. 48 孔板相较 96 孔板，重复效果更好。
3. 在培养细胞时，使用牛血清会导致荧光背景较高，因此可以用低 Ig 含量的胎牛血清或无血清培养基进行细胞培养。
4. 14 和 15 步选做，通常固定一次即可。
5. 二抗孵育开始注意避光，防止荧光猝灭。
6. 清洗时注意不要使液体直接冲击样品，防止样品脱落或碎裂。
常见问题
1. 背景高
解决办法：
① 在培养细胞时，将常规的牛血清换成低 Ig 含量的胎牛血清或无血清培养基；
② 延长封闭时间或增加一抗二抗后的洗涤时间，保证封闭和洗涤的较为充分，尽量把液体完全弃除。
③ 操作过程中，速度要快，以免细胞干掉。
2. 无荧光
解决办法：
① 设置阳性对照，排除抗体失效、错加或漏加的可能；
② 细胞是否污染。
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