手把手教学——CRISPR-Cas9系统：sgRNA的设计及质粒构建

Rose

CRISPR-Cas9系统基本工作原理涵盖了一系列分子事件，从CRISPR序列适应外源DNA片段，通过转录和加工生成成熟的CRISPR RNA（crRNA）或合成单导RNA（sgRNA），到sgRNA与Cas9蛋白的复合形成。
该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA，触发Cas9的内切酶活性，引发目标DNA的双链断裂。
细胞察觉到断裂后，启动修复机制，包括非同源末端连接和同源重组，以实现基因组的精准编辑，为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。



一、sgRNA的设计原则
1、特异性：确保sgRNA是特异性的，以免在基因组中发生非特异性的编辑。避免选择与其他基因序列相似的区域，特别是避免在基因组中存在多个拷贝的区域。
2、GC含量均衡：sgRNA的GC含量应该在40-60%之间，以确保在实验条件下有适当的稳定性和杂交性。
3、避免多个剪切位点：选择只有一个目标剪切位点的sgRNA，以避免非预期的多基因编辑。
4、避免重复序列：避免选择在基因组中存在重复序列或高度相似序列的区域，以减少非特异性剪切的可能性。
5、避免RNA结构影响：确保sgRNA序列不包含稳定的二级结构，以提高在实验条件下的有效性。
6、避免选择在基因组上匹配到多个位点的sgRNA，可通过sgRNA设计软件筛选出移码突变率高且脱靶位点较少的sgRNA。
7、构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时，需注意sgRNA的5'碱基最好为G，或者人为添加一个G来提高其转录效率。
8、若要引发移码突变，必须将sgRNA设计在CDS区域，最好靠近编码蛋白的N端，最理想的位置是位于第一或第二外显子上，以生成无功能性蛋白。
9、当基因存在多个转录本时，最好将sgRNA设计在同源区域。

二、sgRNA的设计
1. NCBI获取基因信息，选择编辑区域
在NCBI主页Gene界面输入基因名称搜索对应的基因。此处以人类KAT7基因为例；



2、点击search后，滚动至“基因组区域、转录本和产物”区域，将能够观察到该基因具有多个转录本，其中竖立的绿色方框表示外显子，每个转录本所共有的方框即为同源区。随后，点击GenBank；



3、下载序列，用snapgene打开，即可查看每个同源区对应的具体碱基序列；



4. 滑动网页至mRNA和蛋白质(s)位置，点击以NM开头的链接即可进入相应转录本的序列，不同NM的条目则表示该基因存在不同的转录本；



5、点击，下载转录本序列，用snapgene打开；



6、snapgene打开全长序列，找到所有转录本的共外显子。竖立的方框是外显子，在敲除过程中，目标是最大程度地削减KAT7蛋白的表达，以确保转录本的各个亚型均无法表现，因此，应当有针对性地删除这些亚型共享的基因区域，且最佳选择是尽可能靠近CDS区的ATG起始密码子；



7、在转录本序列中查找共外显子序列，找到共外显子所对应的外显子在转录本上的位置，并做出特殊标记；



8、复制那段外显子的序列到sgRNA设计网站，http://crispor.tefor.net/（网站有很多）；



9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列，选择正确的物种和Cas9蛋白；



10、网站生成的sgRNA序列信息如下，包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息（建议sgRNA设计3-4条，利于高效完成）；



11、设计好的引物送引物公司设计合成。
注意：sgRNA的设计严格按照设计原则进行，需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。

三、sgRNA质粒的构建方法
1、酶切载体
LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点，通过使用BsmB内切酶I，我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书，随后进行胶切、回收并备用。

2、寡核苷酸链引物退火
体系：



退火参数：
37℃ 30 分钟，95℃ 5 分钟，然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃

3、连接
体系：一般室温放置20-30分钟（NEB的快速T4连接试剂盒）



4、质粒转化：
① 从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻，将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞，接着在冰上孵育30分钟；
② 冰上孵育后，将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激，然后返回冰上孵育10分钟；
③ 加入500 μL预热至室温的LB培养基，将混合物置于37℃摇床中摇菌30分钟；
④ 以3000 r/min离心3分钟，弃掉上清，利用冷却至室温的玻璃棒涂布培养皿（AMP抗性），随后在37℃培养箱中过夜生长。
5、挑取单克隆，摇菌，菌落PCR。
6、对PCR生成物进行琼脂糖凝胶电泳，运用凝胶成像仪进行成像，并挑选阳性菌落将其送往测序公司进行测序鉴定。
7、基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养，提取质粒以备用于后续实验室实验。

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本文作者是&#34;小米&#34;同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：小米
校对：煲仔饭
素材：Canva
参考资料：

• https://images.app.goo.gl/2HBsFXcohSjRfXis6
  
• https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR_gene_editing
  

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/710175850