实验技术分享 | 常用的细胞活性检测方法有哪些？

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细胞活性的检测方法众多，其中包括台盼蓝染色法、荧光染色法、克隆（集落）形成法、ATP含量测定法以及比色法等。以下是对几种常用方法的详细介绍：染色计数法⏩ 化学染色法化学染色法中的染色计数法是细胞培养实验中用于检查细胞死活状态的一种常规且高效的方法。该方法直接依赖于死细胞与活细胞对染料亲和力的差异来评估细胞活性，并能够在光学显微镜下清晰地观察到染色效果。根据染料对细胞的不同作用，此法可细分为死细胞着色法与活细胞着色法两类。
在死细胞着色法中，台盼蓝和苯胺黑是常用的染料；而在活细胞着色法中，则常采用结晶紫、亚甲基蓝及甲苯胺蓝等染料。其中，台盼蓝染色法因其高效性和准确性而最为常用。台盼蓝作为一种蓝色细胞活性染料，其特性是无法穿透结构完整的细胞膜进入活细胞内部，这得益于细胞膜对通过物质的严格选择性。因此，在活细胞中，台盼蓝不会被吸收，而只会渗透进入死细胞，使死细胞在显微镜下呈现出独特的蓝色。
基于这一原理，台盼蓝染色法在细胞实验中通常与自动细胞计数仪或血球计数板结合使用，以准确区分活细胞与死细胞，并同时检测细胞膜的完整性。这种方法不仅操作简便，而且结果直观可靠，是细胞培养实验中不可或缺的重要手段。
⏩ 荧光染色法此方法利用某些荧光染料对死细胞与活细胞的不同作用特性，通过荧光显微镜来检测细胞活性。例如，碘化丙啶（PI）无法进入活细胞，但能穿透死亡或正在凋亡的细胞，使这些细胞呈现红色。相反，吖啶橙（AO）能够穿透质膜完整的细胞，并与细胞核DNA结合，发出明亮的绿色荧光。另一种染料，溴乙锭（EB），则仅能进入膜受损的细胞，与核DNA结合后发出橘红色荧光。此外，AO与EB的联合使用（AO-EB双染法）也是鉴定细胞死活的有效手段。
在现有的荧光染料中，荧光素二乙酸酯（FDA）及其衍生物，如CFSE，具有独特的性质。它们本身是非荧光分子，但CFSE能穿透细胞膜，进入细胞后与内源酯酶发生水解反应，从而被激发产生绿色荧光。这种荧光产物仅在细胞膜完整且酯酶活性正常的细胞中生成并积累，且会随着细胞分裂被均匀分配到子细胞中。因此，利用流式细胞仪，我们不仅可以分析细胞的分裂增殖情况，还可以根据细胞的完整性对活细胞和死细胞进行标记。克隆（集落）形成实验克隆（集落）形成实验是一种关键技术，用于评估细胞的增殖能力、侵袭性以及对杀伤因素的敏感性。该实验中，细胞克隆形成率，也即细胞接种后的存活率，是衡量接种细胞贴壁后成活并形成克隆数量的重要指标。值得注意的是，并非所有贴壁细胞都能增殖并形成克隆，唯有那些既贴壁又具有增殖活力的细胞才能如此。当单个细胞在体外增殖超过6代时，其所形成的细胞群体即被称为集落或克隆。通常情况下，每个克隆包含50个或更多的细胞。通过计算克隆形成率，可以对单个细胞的增殖潜力进行定量分析。
此实验常用的方法包括平板克隆形成试验和软琼脂克隆形成试验。这些技术在抗肿瘤药物敏感性试验和肿瘤放射生物学试验中尤为常见。克隆形成率不仅反映了细胞群体的依赖性，还揭示了其增殖能力这一重要性状。ATP含量测定法腺苷三磷酸（ATP，adenosine triphosphate）由腺嘌呤、核糖及三个磷酸基团构成。ATP发光法是一种通过分析细胞内ATP含量来评估细胞活性与增殖状态的方法。作为活体细胞最基础的能量源泉，内源性ATP在细胞死亡时会迅速水解，并经历氧化反应释放出生物冷光。通过光度监测，可以测定ATP的含量，其荧光强度与ATP含量成正比。因此，所测荧光强度能够间接反映出存活细胞的数量。比色测定法⏩ MTT、XTT及CCK-8法MTT法，亦称MTT比色法，是一种评估细胞存活与生长状况的技术。其原理在于，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT还原为不溶于水的蓝紫色甲瓒（Formazan）结晶，这些结晶会沉积在细胞内，而死细胞则不具备这一能力。随后，利用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞内的甲瓒结晶，通过酶标仪在490nm波长下测定光吸收值，根据吸光值（OD值）即可推算出活细胞的数量。在一定细胞数量范围内，吸光值与细胞活性呈正相关。但需注意，MTT法对于悬浮细胞的适用性较差。
XTT与CCK-8均为新合成的四唑氮衍生物，与MTT同属一类物质。它们均能被活细胞线粒体中的脱氧酶降解，生成棕黄色的水溶性甲腿，可直接通过光谱吸收测定OD值，从而评估细胞的生长情况。在电子耦合剂的作用下，它们的还原反应会得到增强，进而提高反应的灵敏度。与MTT法相比，这些方法的主要优势在于其反应产物为水溶性，无需使用裂解液溶解沉淀，也无需吸取上清，因此既适用于贴壁生长的细胞，也适用于悬浮生长的细胞。此外，这些方法还缩短了检测时间，简化了处理步骤，并显著提高了实验的敏感性。
⏩ 乳酸脱氢酶(LDH)释放法LDH是活细胞胞浆内的重要酶类之一。当细胞受损时，细胞膜的通透性会发生变化，导至LDH被释放到培养液中。因此，培养液中LDH的活性与被裂解的细胞数量呈正相关。在LDH催化的酶促反应中，乳酸被转化为丙酮酸，同时氧化型辅酶I (NAD+) 被还原为还原型辅酶I (NADH2)。随后，NADH2通过递氢体——吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)，生成有色的甲臢类化合物。利用酶标仪检测其光密度(OD)值，经过计算即可得出NK细胞的活性。
与结晶紫染色法和MTT比色法相比，LDH释放法在灵敏度、重复性和相关性方面表现出色。该方法简便易行，灵敏度高，且在敏感性、客观性、试剂成本及测定速度等方面均优于结晶紫染色法和MTT比色法。