如何使用PCR技术鉴定两个只相差一个碱基的基因序列?

wolf

如何使用PCR技术鉴定两个只相差一个碱基的基因序列?
原文地址：https://www.zhihu.com/question/666790981

队长是我

我自己常用的方式是通过设计dCAPs引物（网站地址：dCAPS (wustl.edu)），扩增两端基因序列，一条序列可以酶切，另一条序列无酶切位点，通过酶切的方式进行区别鉴定。下面网址介绍了dCAPs步骤：设计dCAPS标记及其酶切产物产物电泳区分的实验 - 简书 (jianshu.com)，请参考，希望可以帮助到你

大力水手

可用技术很多
但是sanger sequencing也就二三十块钱，量大还能优惠，值得花那么多时间在PCR上玩花活吗？

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　　你好！鉴定两个只相差一个碱基的基因序列，可以使用以下几种基于PCR的技术：

　　1.ARMS-PCR(扩增阻滞突变系统PCR):

　　原理:利用引物3’末端碱基错配时，PCR扩增效率显著降低的原理。设计两对引物，其中一对引物的3’末端与其中一个基因序列完全匹配，而与另一个序列错配；另一对引物则与另一个基因序列完全匹配。

　　结果:如果只扩增出其中一个基因序列的片段，则说明样本中只含有该基因序列；如果同时扩增出两个基因序列的片段，则说明样本中同时含有这两个基因序列。

　　2.AS-PCR(等位基因特异性PCR):

　　原理:与ARMS-PCR类似，也是利用引物3’末端碱基错配影响PCR效率的原理。设计两对引物，分别针对两个不同的基因序列，其中一个引物的3’末端与突变位点碱基匹配，而另一个引物与野生型位点碱基匹配。

　　结果:根据扩增产物的存在与否判断是否存在突变基因。

　　3.高分辨率熔解曲线分析(HRM):

　　原理:利用饱和染料法实时监测PCR过程中双链DNA的熔解曲线。由于单个碱基的差异会导致熔解曲线的Tm值发生变化，因此可以通过比较熔解曲线的差异来区分两个基因序列。

　　结果:不同的基因型对应不同的熔解曲线峰形，可以通过软件分析区分。

　　4.Sanger测序:

　　原理:对PCR产物进行Sanger测序，直接读取序列信息，可以明确区分单个碱基的差异。

　　结果:最直接、准确的鉴定方法，可以得到完整的基因序列信息。

　　上述选择方法时的考虑因素：

　　1.实验成本:ARMS-PCR和AS-PCR成本较低，而HRM和Sanger测序成本较高。

　　2.实验设备:HRM和Sanger测序需要专门的仪器设备。

　　3.灵敏度:HRM和Sanger测序灵敏度较高，可以检测到低丰度的突变基因。

　　4.准确性:Sanger测序准确性最高，可以直接读取序列信息。
针对您的情况，如果只需要判断样本中是存在其中一个基因序列还是同时存在两个基因序列，可以选择成本较低的ARMS-PCR或AS-PCR方法。如果需要更高的灵敏度或准确性，可以选择HRM或Sanger测序方法。

大力水手

PCR-SSP法，Taqman/MGB探针法，限制性酶法PCR-RFLP等技术多了去了，而且都是至少应用十几年的很基本也很基础的技术，文献上应用的一大堆，专利相关的就更多了，多学习

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设计引物，最后一个碱基落在那个有差别的碱基上。扩增结果有或无，用于区别那个碱基的不同