刚入实验室，实验菜鸟，想了解实时荧光定量PCR的一些精髓，谁能帮助下？

乔帮主

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·

基本的都知道，但是做实验和应用的时候还是缺乏经验，求各位大神支招！
原文地址：https://www.zhihu.com/question/35554596

清风寡欲

回想我刚进入实验室的时候就接触到了荧光定量PCR，作为一个刚毕业的小白，面对一堆名词，哑巴吃黄连，有苦说不出，一头雾水。扩增曲线、标准曲线、域值、CT值、熔解曲线、基线到底都是什么意思？那些荧光图色彩斑斓的很漂亮但是我好像不认识它？
吾日三省吾身，定量实验做对照了吗？今天就带大家一起学习一下基本概念、实验步骤等实时荧光定量PCR必须掌握的点！
<hr/>RT-QPCR 基本原理和概念

实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过在PCR反应体系中加入荧光染料(SYBR Green)或荧光标记的特异性的探针，与DNA产物特异性结合，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，最终通过相对定量或荧光定量的方法确定各个样本的本底表达量。可以用于检测mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA的基因表达水平。


<hr/>检测方法

• TaqMan 荧光探针：
  PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5'-3’ 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
  
• SYBR 荧光染料：
  在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
  

<hr/>RT-QPCR操作流程




1）样本处理

• 植物组织：以叶片 RNA 提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在 TRNzol 试剂中研磨，研磨要迅速，最好不要超过 1 min 。大约 100 mg 叶片使用 1 ml TRNzol 试剂。
  
• 动物组织：以鼠肝脏 RNA 提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每 100 mg 组织加入 1 ml TRNzol  试剂， 用高通量组织研磨器快速充分匀浆 (2500rpm 2min，肌肉、肠、子宫等组织研磨前须剪碎，2500rpm 3min),  匀浆后观察直至无明显组织块。样品体积一般不要超过 TRNzol 试剂总体积的 10%。
  
• 单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集 (收集细胞数量请不要超过 1×10⁷ ) ：可直接在培养容器中裂解 (容器体积不超过 10 cm³) ,  或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法) 。
  
• 细胞和细菌悬液：离心取细胞。每 5×10⁶ - 1 × 10⁷  细胞加入1 ml TRNzol  试剂。加入 TRNzol试剂前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。细菌在处理前需要加入溶菌酶进行裂解。
  
• 血液与病毒液处理：直接取新鲜的血液或病毒液，加入3倍体积TRNzol 试剂(推荐 0.2 ml 全血或病毒液加入0.6 ml TRNzol试剂) ，充分振荡混匀。
  

2）总RNA提取

• 将处理好的样本室温反应 10 min ，使 TRNzol 充分发挥裂解作用。
  
• 加入 200ul 氯仿，剧烈摇荡 15 s ，不要使用振荡仪。室温放置 10min ，使溶液充分混合均匀。
  
• 4℃ 12000rpm  离心 15min 。离心后溶液分为三层， 由下至上为：酚仿层、中间白色蛋白层和澄清的水层，RNA  存在于水层中。
  
• 取上层水相 400 µL  于新的离心管中，等体积加入异丙醇 (4℃预冷) ，-20℃放置 15 min。
  
• 4  ℃ 12000rpm  离心 10 min 。RNA  沉淀后呈胶状片层。
  
• 弃上清，加入 1 mL 75%乙醇 (4℃预冷) 洗涤 RNA 沉淀。
  
• 轻轻上下翻转，充分洗涤。4  ℃ 12000 rpm  离心 5 min。
  
• 小心弃上清，用移液器将残留液体吸干净。在超净工作台上吹干，时间 3-5 min。
  
• 将 RNA  溶于 50 µL DEPC  水中。静置 5 min ，  用枪吹打使其充分溶解。
  
• RNA  的纯度与浓度检测：NanoDrop 测定提取 RNA  的 OD  值和浓度，根据 260 nm/280 nm  吸光度比值确定 RNA  的纯度，吸光值在 1.8~2.0  时说明 RNA 质量较好。
  
• RNA  的完整性检测：用 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA  的完整性，通常真核生物的 28S RNA 与 18S RNA 条带亮度比为 2:1。
  
• RNA  样品长期保存于-80  ℃冰箱。
  

<hr/>RNA 中基因组 DNA 去除

• 将以下成分加入到一个 RNase/DNase-free 管子中：
  

试剂	_	用量
RNA	_	5µg
10×DNase I Reaction Buffer	_	2 µL
DNase I	_	0.5 µL
RNase/DNase-free ddH₂O	_	Up to 20 µL

• 37 ℃孵育 30min ，加入 1 µL 200 mM EDTA 作为反应终止液。
  
• 65 ℃  孵育 10 min ，失活 DNase I。
  
• 用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 去除情况。
  

<hr/>*紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度
在pH8.0的TE缓冲液（在酸性缓冲液中，Abs 260nm：280nm比值会偏低）稀释RNA，并在260nm和280nm下测量吸光度。
RNA 浓度= 40ug/mL×稀释倍数×Abs 260nm
一般Abs 260nm：280nm比率应该是1.7-2.1，说明RNA的纯度较好。RNA产量会根据材料的类型和数量以及储存条件的不同而变化。
*RNA条带完整度测定
为了评估RNA的完整性，取部分样本做琼脂糖凝胶电泳。完整的RNA条带包括28S，18S和5S核糖体RNA。通常，28S / 18S> 2意味着RNA具有较高的完整度。）
<hr/>3）RNA 的体外反转录
反应混合物，总体系：

试剂	用量
RNA	11 µL
反转录引物	1 µL
5 × Reaction Buffer	4 µL
Ribolock RNA 酶抑制剂 (20U/ µL)	1 µL
Revertaid M-MuLV 逆转录酶 (200U/µL)	1 µL
10 mM dNTP Mix	2 µL
RNase/DNase-free ddH₂O	Up to 20 µL

备注：

• 如果 RNA 模板 GC 含量高或者含有二级结构，将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65 ℃孵育 5min ，冰上冷却，离心，再置于冰上。
  
• 如果使用 Oligo  (dT) 18 或者基因特异性引物，42 ℃孵育 60 min；如果使用随机六聚体引物，25 ℃孵育5 min ，随后 42 ℃孵育 60 min。
  
• 反应产物可直接用于 RT-PCR 反应或者在-20℃保存少于一周的时间。长时间保存，放入-80℃冰箱。
  

*引物设计
在Primer5.0软件上设计特异引物。
引物设计标准：

• PCR扩增子长度：50-180bp
  
• 引物长度：17-25bp
  
• GC含量：45-55％
  
• Tm：58〜68℃，引物对间差异不大于2℃
  
• 碱基要随机分布，尽量均匀。3′端要避开AT，GC rich的区域，避开T/C或A/G连续结构（2-3个）。引物自身和引物间不能存在互补。引物3’末端为G或C
  
• 避免DNA污染，跨外显子接头区
  
• 至少设计2-3对引物，预实验筛选最佳引物
  
• 将所有设计的引物在NCBI数据库中比对以确定它们对靶基因特异性
  

<hr/>4）RT-PCR 程序
反应体系：（左边试剂，右边用量）

cDNA	100ng/ 1 µL
引物 F( 10µM)	0.4 µL
引物 R( 10µM)	0.4 µL
SYBR mix	10 µL
ROX Reference Dye  (50×)	0.4 µL
RNase/DNase-free ddH2O	Up to 20 µL

备注：
一般使用cDNA模板的10倍稀释液，即100ng/ul加入反应体系，因为过高浓度的反转录体系残留如逆转录酶和相关缓冲液组分会抑制DNA聚合酶活性，从而降低扩增效率。

*Real-Time PCR 程序



5）数据分析

• Ct 值：C 代表 Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，因此只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
  
• 相对定量：检测实验组和对照组中一个靶基因的倍数差异。如果对RNA模板的数量不能精确定量，或者只需要知道目的基因的表达差异时，可以使用相对定量法。
  
• 绝对定量：是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。检测给定数量的样品中靶基因mRNA拷贝数。如果想知道每毫升样品中的某基因的拷贝数时，使用绝对定量。
  
• 扩增曲线：早期循环中，荧光信号几乎没有变化。随着反应的进行，每个循环的荧光水平开始显著上升，被称为指数期。一般在在指数期的早期阶段而不是后期的平台期进行定量分析。在指数阶段开始时，所有的试剂仍然是过量的，DNA聚合酶仍然高效，并且扩增产物量还较低，不会在退火时与引物竞争。这些因素都有助于更准确的定量。
  

大力水手

聚合酶链反应 (PCR) 技术是无数研究和测试实验室的主要技术，涉及的领域包括生物医学、 基因编辑 、食品微生物学测试 等 。 荧光定量 PCR 技术使用热循环来促进一系列反应，在这些反应中， DNA 样本会快速、呈指数地复制，从而产生数百万或数十亿个序列拷贝。购买 PCR 仪器 时，重要的是要考虑您的应用的最终目标、热循环设备的准确性和效率以及仪器的容量和灵活性。本文概述了 PCR仪器 可用的不同选项和功能，以帮助 您选购合适的 PCR 仪 。
1. PCR 与 qPCR 与 dPCR
虽然所有 PCR 系统都使用聚合酶链式反应复制 DNA，但不同的系统使用不同的方法来获得特定的结果。这些不同的方法包括标准 PCR、定量 PCR (qPCR) 和数字 PCR (dPCR)。
标准 PCR 仪器通常用于扩增 DNA 以供进一步下游测试和使用；从某种意义上说，这项技术被用作生成产品的一种手段，而不是作为一种分析测试方法本身。扩增的 DNA 只能在 PCR 反应完成后进行测量，而不是实时测量，因此这种方法有时被称为终点 PCR。传统 PCR 扩增的最终产物通常用于下游克隆和测序，也可以使用凝胶电泳进行检查，以在低分辨率（基于条带强度）下确认目标序列的存在及其相对数量。
为了更快速、更准确地定量样品中存在的目标序列的数量，定量 PCR (qPCR)，也称为实时 PCR，在扩增过程中使用荧光探针来监测每个热循环后存在的 DNA 数量。通过观察需要多少个循环才能达到特定的荧光强度阈值，分析人员可以在将结果与标准曲线进行比较时确定起始材料中的 DNA 量。 qPCR 还可以比普通 PCR 更快地确认目标序列的存在或不存在，例如 SARS-CoV-2 的检测（使用逆转录首先将病毒 RNA 转化为 cDNA） .
数字 PCR (dPCR) 是另一种定量方法，其中 PCR 反应在数千个独立的反应室中进行，原始样品中 DNA 分子的绝对数量可以根据扩增完成后有多少反应室产生荧光信号来确定. 与 qPCR 不同，荧光测量不是实时进行的，也不需要标准曲线来量化样品中的 DNA。虽然 dPCR 通常具有有限的通量和比 qPCR 更高的成本，但它在量化 DNA 方面更加精确、灵敏和准确，并且在检测罕见突变和单核苷酸多态性 (SNP) 等应用中较有用。
当您考虑您的应用时，决定是选择终点（定性/半定量）PCR 还是定量（qPCR 或 dPCR）方法相对简单，但 qPCR 和 dPCR 之间的选择可能更加微妙。qPCR 具有高通量、经济高效且对许多应用足够灵敏，但如果具有低检测限的绝对量化至关重要，则 dPCR 可能是更好的选择。
2.温度控制的重要性
热循环仪准确有效地调节和控制样品温度的能力是扩增反应成功的关键，应该成为选择任何 PCR 系统的重点。不同的系统可能在升温速率、温度均匀性和准确性以及跨热块实现温度梯度以帮助 PCR 方法优化的能力方面提供不同的能力。
升温速率是指热循环步骤之间温度变化的速度，在仪器规格中通常表示为每秒摄氏度 (°C/sec)。制造商可能会提供有关最大斜率和平均斜率的信息，并区分仪器的上升斜率（加热）和下降斜率（冷却）。
一般来说，更高的斜坡率对应于更快的运行时间，但购买者应注意不要只关注MAX斜坡率而不检查与仪器速度相关的其他指标。仪器可能只会在短时间内达到其较高升温速率，而平均升温速率将更好地反映温度变化的速度。虽然升温速率规格可能给出某些仪器可以运行多快的一般概念，但在可能的情况下，寻找仪器上展示的实际运行时间的数据，以真实地了解高升温速率如何转化为快速分析。朗基T30 PCR仪的升温速度甚至可以达到7.5℃/sec。
温度的准确性和均匀性也是成功反应的关键，虽然所有热循环仪的设计都是为了产生 PCR 所需的温度，但某些功能可以提供更高的置信度，这对于样品可能有限且结果可靠的应用至关重要。当使用PCR仪器进行高分辨率熔解 (HRM) 分析等敏感技术时，精确的温度控制也至关重要。
加热的盖子可以确保整个 PCR 管更好的温度均匀性，因为没有加热的盖子，样品会蒸发并凝结到温度较低的管顶部。热块设计也会影响温度控制；铝块导电性低，这意味着它们将比更导电的块更慢地实现温度均匀性并且具有更低的升温速率。镀银和镀金的模块虽然昂贵，但可以更快地进行热传递，从而确保整个块的温度分布均匀。
不同的 DNA 目标可能需要不同的温度才能获得较好的扩增结果；例如，富含 GC 的序列需要更高的温度才能变性。理想的退火温度也受到一系列因素的影响——而该步骤的温度通常是根据引物的解链温度、引物对之间解链温度的差异以及试剂浓度、pH 和盐浓度的影响来选择的。使优化反应温度条件成为一项复杂的任务。
具有温度梯度能力的 PCR 仪器旨在通过允许在单次运行中测试多个退火温度来帮助优化 PCR 方法。根据您计划使用 PCR 仪器分析的样品类型和多样性，带梯度功能的PCR仪器虽然价格稍高于普通PCR仪，但对工作效率提升不少。比如：朗基PCR仪- A600 PCR仪-荧光定量PCR仪-梯度PCR仪。
3.加热模块
如前所述，与 PCR 仪器一起使用的加热块可以在温度控制方面产生差异，但加热块的设计——以及仪器适应不同加热块的设计——也会影响通量、耗材成本和灵活性。典型的块将采用 96 孔或 384 孔格式，但也可提供其他格式，如 48 孔和 1536 孔。孔数越高，反应体积越小，吞吐量越高，最初成本更高，但由于每个孔使用的试剂量较少，最终会降低每次反应的价格。选择时需要考虑您要处理的样品数量以及您使用仪器的频率。
一些PCR仪器带有固定模块，而其他仪器允许使用可互换块，从而提供较大的灵活性，可以在 96 孔和 384 孔格式之间或在不同应用的不同块材料之间切换。一些热循环仪还在同一台仪器中容纳多个模块，使不同的协议能够同时在不同的样本集上运行。比如：朗基的Q2000B荧光定量PCR仪同时用拥有4通道检测，适用低位的PCR管、8联排管或96孔板。
由于此组件在温度控制、样品处理和通量方面的关键作用，因此在选择热循环仪时应仔细考虑热块选项。对于样品量较少的实验室，或者那些通常只进行少量检测的实验室，具有标准 96 孔的低成本固定块仪器可能就足够了。然而，模块化、灵活的仪器可能有利于具有更多协议、不同样本量和更多用户依赖同一仪器进行自己的分析的实验室，以及可能希望在未来扩大其通量能力的实验室。
苏州阿尔法生物14年专注生物实验室仪器设备供应和实验试剂、实验室耗材供应，提供的PCR仪器、荧光定量PCR仪、梯度PCR仪、高通量PCR仪等用于分子生物学研究、生命科学等领域。

大力水手

第一节 实时荧光PCR原理

实时荧光 PCR(real-time PCR)是在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测 整个 PCR 反应进程，对起始模板进行定量分析的方法。1995 年第一台实时荧光定量 PCR 仪由美国 Applied Biosystem 公司推出，实现了 PCR 检测由定性到定量的飞跃。与常规 PCR 相比，实时荧光定量 PCR 在反 应体系中加入荧光，提高了检测的灵敏度;引入探针，提高了反应的特异性;扩增片段多为 100-150bp， 缩短了反应时间;无需电泳检测 PCR 产物，实现了闭管检测，减少了污染发生的可能并提高了自动化程度。 此外，该技术将 PCR 方法的应用范围从核酸定性分析拓展到核酸定量分析，以及基因表达差异分析和单核 苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分析等，成为分子生物学领域应用最为广泛的技术之 一。
1、原理：实时荧光 PCR 的原理

实时荧光 PCR 是在普通 PCR 反应体系中加入了荧光标记探针或荧光染料，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累积，荧光信号强度也随之增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度 变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图(见图 5.1)。



图 5.1 实时荧光 PCR 扩增曲线图。

由图 5.1 可以看出，荧光扩增曲线可大致分成三个阶段:第一个阶段是荧光背景信号阶段，在这个阶 段，产物扩增产生的荧光信号被荧光背景信号掩盖，看不出荧光信号有明显变化。第三个阶段是平台期。 在这个阶段，扩增产物达到了一定水平，已不再呈现指数级增加。用等量模板在 96 孔板上做重复实验， 收集到的荧光 PCR 扩增曲线显示，虽然起始模板量相同，但是 PCR 终产物量并不完全相同，根据最终的 PCR 产物量已不能计算出起始 DNA 拷贝数。第二个阶段是荧光信号呈指数级增加的阶段。经研究表明，
在这个阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以选择在这个阶段进行定量分析。
2、概念：荧光定量 PCR 中几个重要概念

在介绍荧光定量 PCR 的数学原理之前，我们需要先了解几个非常重要的概念:基线、荧光阈值和 Ct 值。
基线(Baseline):是指在 PCR 的初始循环期间的信号水平，通常是 3 至 15 的循环之间，此时荧光信 号几乎没有变化。初始循环期间的低信号可以认为是背景或反应的“噪音”。
荧光阈值(threshold):是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，代表的是明显超出基线的扩增信号 水平(见图 5.2)。它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是 PCR 反应前 3-15 个循环荧光信号值标准偏差的 10 倍。在阈值线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的 差值全部相同。
Ct 值:C 代表 Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是 PCR 过程中，每个反应管内扩增产物的荧光信 号达到设定的阈值时所经历的循环数(见图 5.2)。



图 5.2 荧光扩增曲线中荧光阈值、Ct 值示意图。

3、数学原理：荧光定量 PCR 的数学原理:

对于普通的 PCR 反应来说，
Xn = X0 (1+E)n
其中，Xn 为 n 轮 PCR 扩增后，目的基因 PCR 产物的量;n 为 PCR 循环数;X0 为目的基因的初始模 板量，E 为 PCR 的反应效率，0≤E≤1。
由于荧光定量 PCR 反应体系中荧光物质的荧光强度与 PCR 产物的量成正比，所以用荧光强度来代替PCR 产物的量，我们可以得到:
Rn=RB+X0(1+E)nRs
式中，Rn 为 n 轮 PCR 扩增后总荧光信号强度;RB 为本底信号强度;X0(1+E)n 为 n 轮 PCR 扩增后 得到的产物量;Rs 为单位信号强度。
当循环数 n 等于 Ct 值时，所有样品荧光信号强度变化量的对数全部一致，都达到了阈值。
RT=RB+X0(1+E)CtRS
lg(RT-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRs
Ctlg(1+E)=-lgX0+ lg(RT-RB)-lgRs
此时，如果 PCR 反应处于指数扩增阶段，所有样品的反应效率 E 稳定且近似相等;lg(RT-RB)、Rs 也 相同，那么只有 Ct 值和-lgX0 为变量，且这两个变量之间成一次性方程 y=-kx+b。也就是说，所有样品的 lgX0 与到达阈值时的循环数 n(Ct 值)呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数即 Ct 值就可计算出样 品中所含的模板量。
4、分类：荧光定量 PCR 的分类

根据所使用的荧光化学物质不同，可将实时荧光 PCR 分为使用嵌合荧光染料法和荧光探针法。
(一)荧光染料法

荧光染料法是在普通 PCR 反应体系中加入过量荧光染料。荧光染料在游离状态下基本不发光，与双链 DNA 结合后才释放出荧光信号。因此，在 PCR 体系中，随着特异性 PCR 产物的扩增，染料掺入双链 DNA 而产生的信号强度与 PCR 产物的数量是呈正相关的。
荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料。目前最常用的染料分子 SYBR Green I 属于非饱和荧光 染料，Eva Green 和 Solis Green 属于饱和荧光染料。两者的区别是在将 PCR 产物从 60°C逐渐升温到 95°C 制作溶解曲线的过程中，非饱和荧光染料会从已解开的单链上脱落，结合到临近的尚未解链的双链中继续 发光。饱和荧光染料不会重新与尚未解链的双链 DNA 结合，所以使用饱和染料制作的溶解曲线分辨率更高。
荧光染料法的优点是，实验设计简单，无需合成探针，降低了检测成本;操作简便，可用于监测任何 双链 DNA 序列的扩增。
荧光染料法的最大缺点在于可能会产生假阳性信号。由于荧光染料可以与任何双链 DNA 结合，无法区分不同的双链 DNA，因此非特异产物和引物二聚体的存在都会影响检测结果的准确。通过溶解曲线，虽然可以在一定程度上对双链核酸的均一性进行检测，但是精准定量分析一般还是不用荧光染料法，而使 用荧光探针法。
(二)荧光探针法

实时荧光 PCR 中使用最为广泛的荧光探针是 Taqman 探针，Taqman 技术是在 PCR 扩增体系中加入一 对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，探针本身序列与目的基因两 个引物之间的某段序列互补，因此增加了反应的特异性。5’端标记一个荧光报告基团，3’端标记一个荧光 淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号。PCR 扩增 反应发生时，在退火阶段，探针与目的基因互补序列结合。在反应延伸阶段，Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将 探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步(见图 5.3)。Taqman 探针常用的荧光报告基团有 FAM、TET、VIC、JOE、NED 和 HEX 等，常用的淬灭基团有 TAMRA、BHQ、 MGB 和 ECLIPSE 等。
Taqman 探针根据其核苷酸序列 3’端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:普通的 Taqman 探针和 Taqman MGB 探针。MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本地信 号的强度。同时探针上还连接有 MGB(minor groove binder)修饰基团，可以将探针的 Tm 值提高 10°C左 右。因此为了获得同样的 Tm 值，MGB 探针可以比普通 Taqman 探针设计得更短，使得探针设计的成功率 大为提高。
荧光探针法的优点是特异性高，重复性好，定量结果准确。通过合成不同荧光标记的探针，可以在一 个反应体系中实现多重 PCR 及 SNP 检测。缺点是因为需要合成探针，检测成本高。



图 5.3 荧光探针法 PCR 扩增过程中发光原理示意图。

5、荧光定量 PCR 的绝对定量和相对定量

在做荧光定量 PCR 实验时，会根据实验目标确定是选择绝对定量还是相对定量。
(一)绝对定量

绝对定量是测定目标核酸分子的实际拷贝数。绝对定量实验必须使用已知拷贝数的标准品做标准曲线。 标准品可以是含有目的基因的线性化质粒 DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的 PCR 产物。将已知拷 贝数浓度的标准品进行梯度稀释，一般 5 个或 5 个以上梯度。将稀释的标准品和待测样品用相同的引物和 反应体系同时进行实时荧光荧光定量 PCR 扩增。标准品每个稀释度需至少三个重复，建立标准曲线。通过 待测样品的 Ct 值即可以计算出待测样品中目标核酸分子的拷贝数。



图 5.4 荧光定量 PCR 绝对定量标准曲线的建立。

(二)相对定量

在研究基因表达情况时，很多时候我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何，无需知道 该基因的绝对量有多少。
实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，RNA 提取时得率不同，RNA 反转录为 cDNA 的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同。因此在进行基因表达调控研究中需 要用一些内参基因来校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量 恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化。常用的内参基因有 ß-Actin 基因，18S rRNA 基因等。
引入内参基因后相对定量分析的基本公式可以写成


由此派生出两种相对定量的分析方法:双标准曲线法和 ΔΔCt 法。
(1)双标准曲线法
所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因 和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。
双标准曲线法的优点是考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的 避免了误差;应用简便，操作灵活，无需像 ΔΔCt 法对实验进行反复的优化。缺点是每次实验都必需对目 的基因和看家基因做标准曲线。该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。
(2)2-ΔΔCt 法
前面我们讲过，对于普通的 PCR 反应来说， Xn = X0 (1+E)n
当循环数n=Ct，扩增效率 =1时，


2-ΔΔCt 法的具体计算步骤是:首先用每一组待测样本目的基因平均 Ct 值减去待测样本看家基因平均 Ct 值，得到△Ct(待测样本);然后，用对照组目的基因平均 Ct 值减去对照组看家基因平均 Ct 值，得到△Ct (对照组);用待测样本的 △Ct 减去对照组样本的△Ct，得到△△Ct;对得到的结果取相反数，得到-△△Ct， 最后计算 2-ΔΔCt 就可以得出待测样本相对对照组的目的基因表达变化。
该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为 1，在实验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于 0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准曲线。
第二节 实时荧光 PCR 引物和探针设计

在第一节我们已经介绍过，实时荧光 PCR 可以分为荧光染料法和荧光探针法。荧光染料法只是在普通 PCR 反应体系中加入了荧光染料，不涉及探针，其引物设计和普通 PCR 引物设计原理是相同的。在此， 我们主要介绍使用荧光探针法时，Taqman 探针和引物的设计原理。
设计引物和探针时，应先选择好探针，然后设计引物。首先需要寻找目的基因片段，确定种内高保守、 种间高特异的区域作为引物探针设计的靶序列，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段，因为二级结构会   影响反应效率。扩增片段长度最好在 50 bp – 150 bp，GC 含量为 30 - 80%，扩增片段越短，扩增效率越高。 无论是引物还是探针，应避免重复的核苷酸序列，尤其避免 4 个以上连续的 G;引物探针设计好后应互相 进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
具体来说，探针设计应尽可能遵循以下原则:(1)探针位置应尽可能地靠近上游引物;(2)普通 Taqman 探针长度应在 15-45bp(最好是 20-35bp)，MGB 探针长度应在 13-25bp 以保证特异性(;3)Tm 值在 65-70°C， 通常比引物 Tm 值高 5-10°C，GC 含量在 40%-70%之间;(4)探针的 5’端第一个碱基应避免使用鸟嘌呤 G， 因为 5'G 会有淬灭作用。如果选择 FAM 标记，5’ 端的第二个碱基也不能是 G;(5)探针中，碱基 C 的 含量要明显高于 G 的含量;(6)避免探针序列中连续出现 6 个 A;(7)避免 3’端的前 4 个碱基里含有 3 个或以上的 G;(8)避免探针的中间区域含有两个或以上的 C;(9)设计好的探针应做 BLAST 分析， 保证其特异性。
引物设计应考虑:(1)引物序列应在基因的保守区段;(2)上游引物应尽可能靠近探针;(3)避 免引物自身或与引物之间形成 4 个或 4 个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构;(4)典型的 引物长度为 18-24 bp，Tm 值在 55-65°C，GC 含量在 40%-60%;(5)引物之间的 Tm 相差避免超过 2°C; (6)引物的 3’端避免使用碱基 A，避免出现 3 个及以上相同的碱基;(7)引物末端(最后 5 个核苷酸) 最好不要超过 2 个 G 和 C。
引物探针设计原则虽然很多，但是实际上大部分的引物探针设计都是专业软件完成的。比较常用的软 件有 PrimerExpress 和 Primer Premier5。我们需要做的是确定靶基因序列并导入软件，设置相应的参数就可 以了。在实际操作中可以同时设计几对引物和探针，通过实验验证引物和探针的实际使用效果。
第三节 不同品牌荧光 PCR 仪之间的区别

1992 年，日本人 Higuchi 首次发现实时荧光定量 PCR 技术。他在原有的普通 PCR 仪的基础上，增加 了一个激发和检测装置，并通过在 PCR 反应液中添加染料溴化乙锭，实时监测整个 PCR 反应的全过程。 1995 年美国 Applied Biosystems 公司推出了首台 PCR 仪。经过多年的发展，荧光 PCR 仪已从最初的只能 检测单一波长光源发展到可以检测多种波长光源，检测通量也从 48 个增加到 384 个。虽然目前我国也有 国产化的荧光 PCR 仪，但是市场占有率最高的定量 PCR 仪仍是进口产品，厂商依次是 ABI、罗氏(Roche) 和伯乐(Bio-rad)，因此我们主要介绍这三个厂家的仪器。
在选择荧光定量 PCR 仪时，我们需要考虑仪器使用的广泛程度、仪器的检测通量、仪器的荧光通道数量、耗材的开放性、软件设计是否友好、运行速度和使用的灵活性等因素。
1、美国ABI

1995 年，ABI 公司推出了第一台定量 PCR 仪，型号为 7700。 2000 年推出第二代产品 7900 型，2004 年推出第三代荧光定量 PCR 仪 7300 和 7500 型，2007 年推出第四 代荧光 PCR 仪 StepOne 和 StepOne Plus。
7700 作为第一代产品，已经被市场淘汰，因此不再介绍。7900 是 ABI 的第二代产品，它兼容 96 孔板、 384 孔板和 Taqman 低密度表达谱芯片。可以选用手工进样或通过自动加样装置连续进样，且自动装置可 容纳 84 块 384 孔板，机械手臂可按一定顺序将待测样品板运送至主机内，配备的条形码阅读器可自动识 别进入主机的样品板编号，支持 24 小时无人操作。核心应用包括使用基因表达定量和单核苷酸多态性分 析，配套相应的分析软件。热循环系统是基于珀尔帖效应的循环系统，具有样品加热块互换功能，这一功 能增加了仪器使用的灵活性。光学检测系统为 488 nm 氩离子激光激发光源，激发光通过双轴同步扫描头 分布到所有反应孔，通过光栅和冷 CCD 照相机检测荧光。由于采用更为先进的荧光检测技术，7900 在不 降低速度、分辨率的情况下有效提高了产率。一束激光扫描并激活最多 384 个孔的每一个孔里的荧光染料， 荧光信号通过光栅分光，经过分离的多色荧光同时到达 CCD 摄像机，实现多色荧光同时检测。仪器安装 时已校准了 FAM、VIC 和 ROX 三种染料。还可兼容SYBRGreen、JOE、NED、TAMRA 和 TET 染料。半 导体加热模块，加热块 96 孔快速反应板模式下升温速率为 4.8 °C/秒，其他反应板模式下速率为 2 °C/秒。 标准模式下样品的升温速率为 1.6 °C/秒，快速模式下升温速度为 3 °C/秒。反应运行时间最短可压缩至 40 分钟。仪器检测灵敏度高，能够在 99.7 %的置信度下区分 5000 和 10000 模板拷贝数。该仪器的缺点是价 格昂贵，性能比不上 7500，占用空间大，仪器尺寸为 72 cm ×84 cm ×64 cm。
7500 是 ABI 的第三代产品，支持 96 孔板、单管和 8 连管，不支持 384 孔板。热循环系统是基于珀尔 帖效应的循环系统。96 孔加热块极限模式下升温速率为 5.5 °C/秒。标准模式下样品的升温速率为 1.6 °C/ 秒，快速模式下升温速度为 3.5 °C/秒。采用卤钨灯作为光源，卤钨灯光通过五色光源滤光片后激发每个分 析样品。卤钨灯光源增加光源滤光片后改善了长波长红色荧光标记的激发效果，提高了红色荧光检测的灵 敏度和准确性。五色荧光滤光片能够有效地分辩包括:FAM / SYBRGreen、VIC / JOE、NED / TAMRA / Cy3、 ROX / Texas Red / Cy5 在内的多种荧光染料。上述染料在安装时已经过校准。最多可支持四重 PCR(ROX 占用一个荧光通道)。仪器检测灵敏度高，能够在 99.7 %的置信度下区分 5000 和 10000 模板拷贝数。20 μL 反应体积单一报告荧光 Taqman 实验中可检测低至 10 个起始拷贝数的模板，置信度达 99.7 %。该仪器尺寸 为 34 cm ×45 cm ×49 cm，明显较 7900 小。
StepOne Plus 是 ABI 推出的第四代荧光 PCR 仪，体积很小，仅为 24.6 cm ×51.2 cm ×42.7 cm，价格较 低，适用于各种实验室环境。支持 96 孔板，热循环系统采用珀尔帖效应系统，加热块为 Veriflex 加热块， 具有 6 个独立控温区，可同时扩增 6 个不同退火温度的 PCR 产物。加热块最高升温速率为 4.6 °C/秒，样 本快速升温速率为 2.2 °C/秒。光学系统采用 LED 激发光源，4 色荧光检测系统，安装时已校正的染料有 FAM、VIC、JOE、NED、TAMRA、SYBRGreen 和 ROX。支持单机运行模式，LCD 触摸屏控制，支持 USB 存储，可实现无 PC 操作。可以进行标准模式和快速模式 PCR 反应，快速模式可将反应时间缩短至 40 分钟。
2、罗氏诊断

罗氏公司的荧光 PCR 仪型号为 LightCycler，目前已上市的型号有 LightCycler 1.5、LightCycler 2.0、 LightCycler 480、LightCycler 96 和 LightCycler Nano 等。与 ABI 仪器不同，LightCycler 采用 Therma-Base 热循环技术，热传导速率可达 20°C/秒，升降温速度快，大大缩短了仪器运行时间。反应时间短是罗氏荧 光 PCR 仪最大的优点之一。使用 LED 冷光源，维护成本降低，寿命长达 2 万小时以上。改良光路设计， 确保检测的均一性，彻底消除了边缘效应。不需要使用 ROX 校正，从而相较 ABI 荧光 PCR 仪，在荧光通 道相同的时候可以多一种荧光标记。
Lightcycler 2.0 检测样品量为 32 个，荧光检测通道由 Lightcycler 1.5 的 3 通道增加到 6 通道，提供 530 nm、560 nm、610 nm、670 nm 和 710 nm 的荧光检测。Lightcycler 96 是一款针对中通量实验需求开发的仪 器，检测样品量为 96 个。Lightcycler 480 是针对高通量实验需要而设计开发的创新一代 96 / 384 互换式荧 光 PCR 系统，秉承了 Lightcycler 系列一贯的高速、准确的特质，采用革新的 Therma - Base 模块加热技术 和独特快速散热装置，确保了孔间温度的均一性;同时匹配以先进光学检测系统，确保信号的整体采集和 检测灵敏度最大化，提供 5 色激发通道和 6 色荧光检测通道并具有颜色补偿功能。
下表是在网上查到的常见几种荧光 PCR 仪，如 Roche LightCycler96、ABI 7500fast、Bio-rad CFX96、 Stratagene Mx3000P 、Qiagen Rotor-Gene Q 的性能对比，供参考。



表 5.1 Roche LightCycler96、ABI 7500fast、Bio-rad CFX96、Stratagene Mx3000P 、 Qiagen Rotor-Gene Q 五种荧光 PCR 仪性能对比



表 5.1 续 Roche LightCycler96、ABI 7500fast、Bio-rad CFX96、Stratagene Mx3000P 、 Qiagen Rotor-Gene Q 五种荧光 PCR 仪性能对比

（未完待续）
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《实战宝典》_仪器信息网​www.instrument.com.cn/zt/szbd相关阅读：
万字干货，关于PCR基因扩增仪的一切

队长是我

1. 获取优质RNA



2. 设计特异性引物



3. 选择合适的标记方法

荧光染料嵌合法（SYBR Green I）



荧光探针法(Taqman探针）



TaqMan探针的设计和荧光标记物选择





分子信标法



三种荧光定量PCR方法的应用比较



4. 标准曲线分析

一般，DNA样品的定量标准品为基因组DNA&质粒，RNA样品的定量标准品为Total RNA&cDNA&体外转录RNA。绘制标准曲线的标准品梯度的选择一般为5~6个梯度，标准品的稀释倍数通常为10。





5. 熔解曲线分析

SYBR Green I 法进行检测时，可根据熔解曲线确认PCR产物的特异性。曲线横坐标是温度，纵坐标是荧光强度的变化值（不是强度本身）。其原理是依据温度从60度升至90度时，荧光强度的变化值。当温度达到PCR产物的Tm（双链DNA分子解链一半时的温度）时，荧光强度变化最大（峰值）。





6. 绝对定量分析方法

绝对定量中，LOG（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可制作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系。然后根据样品的Ct值，来确定未知样品的初始模板拷贝数或浓度。通常用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。



其中，标准品的稀释方法与拷贝数计算如下图所示：



7. 相对定量分析方法

相对定量用于测定单个样品基因的差异表达分析或者比较两个或两个以上样品中某个基因表达量的变化，则其结果必须用内对照基因（管家基因）校正。管家基因通常指维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH/Actin/18s rRNA等，实际操作中可依据文献或具体实验进行筛选。相对定量的分析方法主要有两种：双标准曲线法和2^-△△Ct法。
双标准曲线法：
每次实验都要分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线，并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的基因和内参基因的表达量。最后通过公式就可以计算出目的基因的表达差异了。



2^-△△Ct法
这是最常用的进行相对基因表达分析的方法，得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率相同，且相对偏差不超过 5%。



若是目的基因和内参基因的扩增效率不一样时，可以套用以下公式来计算基因表达的差异。



其中，E1：目的基因引物扩增效率；E2：内参基因引物扩增效率；△Ct1：实验组目的基因Ct值差；△Ct2：对照组目的基因Ct值差。（E1=E2=1时，该公式=2^-△△Ct）
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作者：科研小助手
原文链接：http://www.bioengx.com/2017/06/01/qrt-pcr/
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是分子实验室家喻户晓的基因表达定量技术。无论是刚入实验室的菜鸟，还是久经沙场的老手，都需要时不时用一下这个高大上的技术来进行转基因的检测、突变体的鉴定、组织表达的定量或标记基因的表达。对于大多数老手而言，qRT-PCR不过是配一板PCR体系丢到机器里去，静等两个小时结果出来的一个小实验。然而对于刚进实验室不久的生物小白们，花了两周时间从各大平台和课本中好不容易掌握了SYBR Green的发光原理、Ct值的定义、甚至可以根据ΔΔCt公式手算定量结果，真正开展实验时，却发现自己面对的唯有一机器、一酶、一PCR板、一移液枪而已。
所以说，qRT-PCR的体系究竟要怎么配置？和普通的PCR有何区别？如何选择合适的酶？如何加样才能避免污染？怎么配体系才能做到“三线合一”？配完体系后有又如何进行程序及参数设定？你是不是掌握了qRT-PCR所有原理但操作起来还是无从下手？如果你并不知道这些实验干货，赶紧搬好小板凳，拿出记录本，这篇文章就是为你而准备的。
qRT-PCR的引物设计注意事项
qRT-PCR有自己的引物标准，简单而言，引物设计要用专门的软件，包括内参基因与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外，还需要注意以下法则：1）用于突变体的基因表达量鉴定时，引物最好设在两个外显子之间，横跨中间的内含子，这样可以避免DNA的污染；2）用于过表达基因表达量时，需找出该家族所有同源基因并进行比对，并在保守性最差的区域设计引物；3）用于标记基因检测的引物序列最好来自发表的文献。
除此之外，内参基因的选择也需要稍微走下心。以模式植物拟南芥为例，常用的内参基因Actin2和Actin7虽然在营养组织有稳定的高表达，但在花粉、胚胎及种子部位几乎无表达。因此如果进行组织特异性表达测定时我们应该选择28S，而不是Actin2或Actin7。当然，这些内参基因的引物序列也最好引用自发表的文献。
最后值得注意的是，引物用完后需放入-20℃保存。尽量避免反复冻融，如果多次使用可在第一次溶解好后进行分装。如果在实验过程中出现以前能扩增的基因扩不出的现象，多半是引物降解或部分降解导致的。在实验期间引物解冻后需用涡旋混匀，离心待用。
qRT-PCR的模版需求
通常而言，如果你想做一个突变体鉴定实验，那么模版质量要求可适当放宽，只要cRNA反转录成功即可。但如果你要做一个厉害的标记基因鉴定，并且想要达到传说中“三线合一”的境界，那么模版质量就另当别论了。首先，RNA要经过严格的定量（因为反转成cDNA后，反转时加入的dNTP会严重干扰定量结果，因此对cDNA定量是没有意义的）。尽量取等量的、未降解的RNA进行反转录（并选择含有DNAase的试剂盒）。反转好的cDNA模版需一次性稀释20-30倍，不可长期保存，每次用时前先混匀再离心。qRT-PCR实验最好在一个星期内完成。
qRT-PCR中SYBR Green酶的选择
工欲善其事，必先利其器。高质量的酶是保证高质量结果的前提。现在市售的酶多为2 X MIX的形式。在市售酶的选用方面，我们首先应该选择稳定、扩增效率高的酶，其次还应注意解冻后的MIX粘性不宜过大（粘性过大的MIX会导致加样时枪头出现挂液），最后应注意同一板qRT-PCR体系不宜用两管MIX，即加完一管发现不够用，继续开一管新的MIX接着加。正确的做法应为先估算总体系，将两管MIX预先加到一起，混匀后离心，用混匀的MIX配置体系。
qRT-PCR中体系的配置
qRT-PCR要求对每个样品做三个平行体系。一般来说，每个最终的反应体系为10μl（然而试剂盒上推荐的体系为25 μl，但这样既浪费酶，用中号枪头加样还降低了重复性）。最好用10 μl小号进口枪头加入。
配体系时，一般先将水、MIX及引物混成3倍体积的总体系（此时应给每管留1.5ul的损耗，另外有些仪器还要求加入适量Passive Reference Dye用于标定仪器），再用排枪分装入qRT-PCR板。模版要在最后，最后，最后用排枪加入（稀释20-30倍后，模版可加至1 μl以上，大大提高了可重复性）。
最后附一些实用的qRT-PCR体系配置技巧：
1）在冰上配置体系；
2）所有的枪头和PCR板都用进口的；
3）尽量用排枪进行平行操作，尽量用同一枪头完成样品分装；
4）模版加在管壁上，这样在不换枪头的前提下可有效避免样品污染，最后用96孔板离心机离心。
qRT-PCR程序的设置
目前市面上有许多进口或国产的qRT-PCR仪器，关于这些仪器的参数设置，我们可以请教师兄师姐或拨打公司的服务热线。
而反应程序的设置，则需要参考购买的SYBR Green酶的说明书。值得注意的是，虽然说明书中大多数SYBR Green酶的扩增效率都显得牛逼闪闪（如三步法时循环部分的程序为95℃ 30s，50-60℃ 5s，72℃ 15s），但倘若扩增效果不尽人意，适当延长退火及扩增时间也许会大有帮助哦。
好了，有了这么多qRT-PCR体系的配置技巧，小伙伴们只要做到不染风尘、心无旁骛、人枪合一，稍加练习后，配制高质量的qRT-PCR体系必将不在话下。