【科普】99%的人不知道的CRISPR奥秘

John

众所周知，这几年大火的CRISPR基因敲除技术是受细菌免疫系统启发而来、并应用到哺乳类动物细胞上的一项突破。
这项技术主要由sgRNA定位到一个基因位点上，由Cas9酶在该位点进行DNA双链的切割，切割导致DNA修复通路的激活，使得其它的碱基加入进切割的位点，造成frameshift突变，使得基因无法被表达成功能性蛋白。
CRISPR敲除基因的具体原理是什么呢？




Cas9由的RECI/II, HNH, RuvC, Bridge Helix, Pam Interacting这些domain组成

• 首先，sgRNA和Cas9相结合。Cas9发生了形状上的变化，形成激活状态。
  

• PAM是target DNA上的一小段序列，不同的Cas9识别不同PAM。
  
• 拿Streptococcus pyogenesis中的Cas9来说，它识别的PAM是5′-NGG-3′
  
• 因此在设计sgRNA的时候，需要先找到GG，然后取其旁边的序列。
  
• 大部分基因序列都有GG。但如果没有GG，就用其它细菌提出来的Cas9来做。
  

2. Cas9会在PAM上游第三个碱基后切断双链，由Cas9的HNH和RuvC部分来进行剪切。
3. 双链断裂（DSB）之后，会有两种修复方式发生的可能：

• Non-Homologous End Joining (NHEJ)
  
• Homology Directed Repair (HDR)
  

Cas9造成基因不被表达是由NHEJ修复通路引起的，NHEJ修复通路如下（右B）：



HR vs. NHEJ

• 首先，Ku70/Ku80识别DSB
  
• 之后，DNA-PKcs 和XRCC4-ligase IV会被招募过来，同时还会来PAXX, XLF，形成一个complex, 这个complex会把DSB修复好
  
• 这个过程会引发1-10个碱基的插入，由2/3的几率会引发frameshift 突变，导致基因无法被表达，也就是我们说的基因敲除。
  

<hr/>然而，Cas9造成的DSB并不一定会引发NHEJ，因为DSB end的碱基并没有任何损坏，这种end也叫blunt end，很容易再次粘连在一起。那么突变是怎么引发的？
事实上，即便blunt end再次粘连在一起，sgRNA会再次识别这段序列，然后Cas9会再次切，反复下去，直到发生了由NHEJ引导出的突变，sgRNA才不会识别这段序列。
<hr/>非特异性敲除的改善

sgRNA非特异性结合引起的突变一直是一个问题，那么这个问题是怎么改善呢？
张峰团队想到了一个方法，既然两条链的断裂容易引起变，我们只让一条链断裂不就行了吗？而一条链的断裂又不足以引起位点基因的突变，那么加入两个引起单链断裂的酶不就行了吗？
事实证明，这个想法是有效的，他们成功地把非特异性降低了50到1500倍，并把这个技术称为CRISPR Double Nickase，发在了《细胞》杂志上。
CRISPR DOUBLE NICKASE 敲除的具体原理是什么？

和普通Cas9不同的是，Cas9n (Cas9 Nickase)上有一个D10A的氨基酸突变，这个突变使得Cas9不再导致DNA双链断裂和NHEJ修复（一种会引来突变的修复），而是会引起单链断裂和BER修复（一种不会引起突变的修复），如下图。



左边WT Cas9可切割双链，右边的Cas9 Nickase只能切除一个链

利用Cas9 nickase只能进行单链剪切的特性，张峰团队想到把两个Cas9 nickase共同作用在一个基因位点上，使其形成双链断裂（DSB），而非特异性结合则不会引起DSB，这样就降低了非特异性突变。



两个只能切割单链的Cas9作用在临近位点上，在该位点上形成DSB

两个cas9的距离要多远效果才最好呢？经过测试，团队发现下图的offset在-8到8bp之间引起的NHEJ最好。超过8bp到100bp效果也可以。



offset=4bp

<hr/>DOUBLE NICKASE 在实验室是如何操作的？

拿Santa Cruz的double nickase plasmids举例，里面一般包含两个plasmids（一对儿sgRNA），一个带puro，一个带GFP。



Double Nickase Plasmid

Double Nickase步骤如下：

• ~2e5 cells/ well in 6 well plate
  
• Transfect 1-3 ug DNA using transfection reagent
  
• 24-72h later, replace media
  
• single-cell (1-50 cells/well) sort GFP+ cells in 96 well
  
• after expansion, treat cells with 2-10 ug/ml puromycin
  
• 5d later, cell assay: WB/ RT-qPCR to check expression level
  

<hr/>“CRISPR系统除了用来做基因敲除，是否还有其它的应用呢？”

                                    “当然，除了敲除基因，CRISPR还可以用来激活基因。”

<hr/>如何利用CRISPR系统来激活基因？

sgRNA的基因定位功能简直不要太好，而即便让Cas9的“剪刀”突变了，Cas9依然能和sgRNA结合。既然如此，不妨在突变的Cas9和sgRNA上加入一些促进基因转录的元素？
在Cas9上加入促进基因转录的元素其实并不难，因为Cas9是一种蛋白，只需要在蛋白上面连上一些促进转录的蛋白即可。
那么在sgRNA上如何加入这个元素呢？sgRNA可不是蛋白，它是RNA啊。RNA要怎么样才能连上蛋白？
张峰团队想到了Aptamer（一种帽子形状的RNA）和MS2（一种蛋白）可以互相结合，那么不妨把这个RNA和蛋白的结合应用到sgRNA上？
这项成果最终发表在了《自然》杂志上：

在分析完sgRNA和Cas9的晶体结构之后，他们发现sgRNA有两个loop裸露在Cas9蛋白外，即下图中红色的部分（Tetraloop 和 Stem loop2），它们不参与任何作用。这不刚好可以用来添加aptamer的小帽子吗？



sgRNA两个loop裸露在外，即红色的部分

他们把sgRNA裸露在外且无用的两个loop替换成了aptamer，使sgRNA具有了和MS2结合的能力。这样一来，就可以在MS2蛋白上添加有助于转录的蛋白了。



左边两个红色的圆圈（小红帽）就是aptamer，右边橙色的蛋白是MS2。

在他们提出在sgRNA上加帽子的想法前，能做手脚的就只有一个，就是在dCas9（dead Cas9）上安装TAD（Transcription activation domain），比如VP64。那么现在呢，不仅能在dCas9上添加各种元素了，还能在MS2上添加各种元素了。

在他们尝试了各种组合之后，发现VP64：dCas9 和 HSF1-p65：MS2 的组合最好， 于是就有了我们今天的SAM （Cas9 Synergistic Activation Mediators）了。SAM的工作原理如下：



dCas9相连的VP64和sgRNA招募过来的p65和HSF1会共同促进转录

下面是一些关于这个系统中部件的介绍。

• VP64: 来源于VP16, 是它的四聚体，所以16x4=64，就叫VP64了。
  
  
  
  • VP是virus protein的缩写，VP16来源于herpes simplex virus (HSV), 是transcription factor, 用于在被感染的细胞内促进一些基因的表达。
    
  • 它主要有两个domain，一个用来帮助结合DNA，一个用于招募PoI II 等负责DNA转录的因子促进转录，叫Transcription activation domain (TAD)。
    
  • 后来人们利用TAD能招募转录因子的特性，只选取VP16的TAD部分(amino acids 437-447: DALDDFDLDML)，并把它复制成四份，用GS linker相连，就成了VP64。
    
  
  

VP64 = VP16 x 4

• dCas9: 将Cas9 负责剪切的部分，即HNH和RuvC domain, 进行突变(D10A/H840A)，使其不能进行剪切。
  

Cas9的两个domain, HNH 和 RuvC负责剪切

• HSF1-p65-MS2
  
  
  
  • MS2: 用来和aptamer结合
    
  • p65：选用p65的TAD部分
    
  • HSF1：选用HSF1的TAD部分
    
  
  

不同转录因子的TAD部分相互叠加，有synergistic的效果，要比单一的TAD强。
PS: 目前还有好多转录因子的TAD没有尝试，效果也许会比VP64/p65/HSF1组合更好。
<hr/>
CRISPR 基因激活在实验室是如何操作的？

这里拿Santa Cruz家的activation plasmid举例：



sgRNA plasmid + Puro


Activation plasmids包括三个plasmids，分别是dCas9-VP64, MS2-P65-HSF1，和sgRNA：



SAM实验步骤：

• ~2e5 cells/well in 6-well plate
  
• 1-3ug DNA, transfection
  
• 24-72h later, replace media --> cell assay 48h after transfection
  
• antibiotics selection, puro: 1-10ug/ml, hygro: 200-500ug/ml, blasticidin: 1-20ug/ml
  
• replace media with antibiotics every 3 days until resistant colonies are formed
  
• pick colonies using 10 ul pipet tip under 10x lens microscope
  
• grow in 96 well and expand
  
• cell assay again: WB and RT-qPCR
  

<hr/>以上就是利用CRISPR系统进行基因激活和敲除了。是不是很简单呢？科科。

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