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[分享] 有没有大佬指导一下PCR及其原理?

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发表于 2024-9-20 20:04 | 显示全部楼层 |阅读模式
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发表于 2024-9-20 20:04 | 显示全部楼层
聚合酶链式反应(PCR),即DNA扩增法,是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。这种技术最早是在1983年被美国的Mullis提出,并于1985年被发明。PCR技术从发明至今已有35年历史,技术发展相对成熟。
PCR技术发展至今已至第三代,经历了定性PCR技术、定量PCR技术(qPCR)与数字PCR技术(dPCR)三个阶段。不同阶段的PCR技术的特点、应用情况与行业发展情况也不尽相同。



图1.数字PCR发展

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术。dPCR检测过程主要包括样品的分散、PCR扩增、荧光信号采集与数据分析。试验结果通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计,根据泊松分布公式计算出DNA模板分子的起始浓度,从而实现绝对定量。




图2.数字PCR操作流程

在介绍数字PCR之前,首先和大家回顾一下荧光定量PCR技术(real time PCR, qPCR)。荧光定量PCR在操作流程上包括:a.核酸分子提取;b.RNA逆转录;c.荧光定量PCR检测这三步骤。在检测原理上荧光定量PCR主要包括两种方法:a.染料法(SYBRGreen或Eva Green);b.Taqman探针法。
数字PCR(digital PCR,dPCR)
数字PCR技术,是一种荧光定量PCR技术的升级技术。依然是利用染料法或Taqman探针法进行的荧光检测,不同的是dPCR是终点检测荧光信号,qPCR是实时检测荧光信号。而数字PCR之所以是荧光定量的升级技术,主要是利用单分子扩增实现核酸的绝对定量。数字PCR将单个DNA分子置于独立的反应室中,并对其进行PCR扩增,利用TaqMan探针法或染料法检测特定的靶序列
数字PCR检测主要包括三步:第一,通过特定技术将PCR反应混合液分散到几万个反应单元(反应室);第二,单分子在反应室中扩增;第三,PCR结束后检测荧光信号,最后通过泊松分布统计数数,计算出样本的拷贝数,实现核酸分子的绝对定量。与qPCR相比dPCR的绝对定量不需要利用标准曲线实现定量,而是直接可以通过单分子扩增结合泊松分布统计,既可实现绝对定量。
因此,数字PCR与荧光定量PCR不同点,主要体现在数字PCR需要进行分区后扩增,而荧光定量PCR是不需要分区扩增,而这种分区即可实现核酸分子的单分子扩增,单分子扩增既可以提高扩增效率,同时可以提高荧光检测的灵敏性和数据的可重复性。
dPCR与qPCR比较
实时荧光定量PCR可以进行相对定量,利用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线,在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较,从而得到目的基因的量,标准品可选择纯化的质粒DNA或体外合成的ssDNA等,qPCR的定量是相对标准品的定量,是一种相对定量技术。
数字PCR 是基于传统PCR、实时荧光定量PCR基础上发展起来的第3代PCR技术,它不需要标准品,也不要制作标准曲线,即能实现更灵敏、更准确的绝对定量。同时,数字PCR是单分子扩增技术,能够有效避免反应抑制剂的影响。随着反应室的增加,反应受到抑制剂的影响就越小。



表1.dPCR与qPCR比较

数字PCR分区方法
数字PCR的主要核心点在于将PCR反应液分区至数万微反应单元,实现单分子扩增。不同厂家利用不同方法实现核酸分子的分区,目前数字PCR分区方法主要包括2种:微滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)和芯片数字PCR(Chip digital PCR,cdPCR)。分别通过微液滴和微流体芯片实现分液,分隔开的每个微小区域都可进行单独的PCR反应。
1)ddPCR技术,利用油包水微滴生成技术。2)cdPCR利用微流控芯片技术将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上。
数字PCR技术应用
数字PCR具有明显的优势,已经广泛应用于核酸检测的方方面面。肿瘤液态活检,遗传生殖检测,公共卫生检测,环境微生物检测,RNA表达检测,NGS文库定量,甲基化检测的等。后期将推出数字PCR具体的应用,欢迎大家持续关注。也希望大家了解数字PCR后,能够帮助大家更好地解决目前面临的困难。
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发表于 2024-9-20 20:05 | 显示全部楼层
PCR是分子生物学的核心技术,功能强大。可在体外高效快速地对不同来源的特定DNA或RNA序列进行酶扩增。标准的PCR反应由目标DNA、一组目标DNA序列旁侧的合成寡核苷酸引物、一种热稳定DNA聚合酶(通常是Taq聚合酶)以及核苷酸组成。在热循环仪中,每个扩增循环分三个阶段:首先,双链DNA(dsDNA)变性成为两个单链DNA;其次,引物退火与目标DNA序列结合;最后, DNA聚合酶从引物开始延伸DNA进而产生一条由一条新链和一条母链组成的新双链DNA。而循环中新产生的每条DNA链都会成为下一个循环中的模版,因此只需20个循环DNA就可以增加100万倍。 如果感兴趣可以到默克www.sigmaaldrich.cn看具体内容
逆转录酶 PCR (RT-PCR)

RT-PCR,或称逆转录PCR,由标准PCR技术衍变而来,可对从极少样品中提取出的特定信使RNA进行扩增。免去了传统克隆技术中冗长的信使RNA提纯过程。在逆转录PCR中,除使用标准PCR反应物外,还可使用逆转录酶和RNA样品。其中逆转录酶在反应被加热到37摄氏度时可从RNA样品中合成一条互补配对的cDNA拷贝。然后,这条cDNA链与引物退火配对合成第一条链。之后按标准PCR的流程生成双链DNA。逆转录PCR经常与实时定量PCR(qPCR)结合,广泛应用于细胞及组织转录水平的定量分析。
热启动PCR

热启动PCR技术用于在热激活执行前抑制反应中热启动Taq聚合酶活性或阻止经修饰脱氧核糖核酸的聚合。控制热启动聚合酶的活性的方法多样,包括化学修饰、抗体介导及适配体介导。
利用终点PCR对较长目标准确扩增


终点PCR通常在反应完成后用于探测目标是否存在及其相对丰度。由于附加了具备“校正”功能的元素,标准PCR能合成序列的长度最高为5000个碱基对。而兼具长度及准确度 (LA)的PCR结合第二种具有3’ 5’ 外切酶功能的热稳定聚合酶可修复末端核苷酸错参,所以不仅能够扩增长达40000个碱基对的DNA目标链,还极大地提高了其准确性。

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发表于 2024-9-20 20:06 | 显示全部楼层
还是搞不懂PCR 的原理?看过来,下面让你一分钟学会PCR 技术原理及实验工作流程。
PCR 技术原理类似于DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,通过变性- 退火- 延伸三个基本步骤完成:
变性步骤使得模板DNA 双链或者PCR 扩增形成的双链DNA解离,成为单链,变性温度一般在93 °C 以上;退火步骤使得单链DNA 模板与序列互补的引物配对复性,退火温度与引物的Tm 值相关;延伸步骤使得DNA 模板- 引物结合物在72 °C、DNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为底物,靶序列为模板,按照碱基互补配对和半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 互补的半保留复制链。
重复循环以上三个步骤就可以获得更多的半保留复制链,而新链又可成为下次循环的模板,即扩增产物呈现指数增长,直至反应体系中的某个组分变为限制因素为止,产物不再按照几何方式积累,逐步进入PCR 反应平台期。



图1:PCR 指数扩增理论



图2:PCR 虚拟扩增曲线(Eppendorf 2012)



图3:典型PCR 程序 http://www.baike.com/wiki/PCR

PCR 工作流程




图4:PCR 工作流程,注:RNA 需反转录为cDNA 后进入PCR 步骤。

PCR 实验的第一步是制备模板DNA,无论是基因组DNA/RNA、质粒DNA 还是PCR 产物,我们均需进行纯化步骤,确保模板DNA 质量,排除PCR 干扰物质,如蛋白质、多糖等,还要防止PCR 抑制剂的污染,如酚类、乙醇的残留。

  • Tip 1:纯化后的DNA 建议使用TE 缓冲液进行保存,如近期不用,请分装后置于-20 °C 冰箱保存,RNA 需分装后置于-80 °C 超低温冰箱保存。
PCR 实验第二步为核心步骤,细分包括PCR 反应液预混、加入模板DNA/cDNA、运行PCR 程序。
将PCR 反应液中除模板DNA 外的试剂进行预混后,分装到各个PCR 管中,保证反应体系一致,在进行试剂预混时,建议使用混匀仪进行,不推荐移液器吹吸和手动弹振,商业化的Taq 酶中通常会包含50% 的甘油,防止反复冻融影响酶活,如不进行有效混匀,Taq 酶分布不均,严重影响PCR 结果。

  • Tip 2:如需补水,请使用灭菌后的超纯水,建议不要重复使用,灭菌后请分装后冷冻保存。其他试剂如可能,建议均进行分装保存。如不使用热启动Taq 酶,操作时请将酶和预混液冰浴放置。
加入模板DNA/cDNA 前,亦需要将其进行充分混匀后加样,确保结果重复性。如需加入多个模板,请清晰标记,以免混淆,并在加完一个模板后立即盖严PCR 管盖,防止交叉污染。加入模板DNA 后,请混匀并瞬时离心。
运行PCR程序前,请确保PCR仪性能正常,且PCR耗材与PCR仪适配。热盖温度设置要高于模块温度,一般设定为105 °C,目的是防止PCR 反应液蒸发;PCR 程序的温度条件和时间,需要根据模板DNA 的特性、引物Tm 值和Taq 酶的特性进行设置,PCR 程序完成后建议在10 °C - 16 °C 保温,在确保无非特异性PCR 产物生成的同时延长PCR 仪使用寿命。在PCR 优化实验中,梯度温度功能能够帮助我们快速找到最佳反应条件。

  • Tip 3:如所用仪器为Eppendorf 产品,建议激活TSP 功能(样品保护功能:当热盖升温时,加热模块20°C 保温),可降低非特异性产物的生成几率。
定性PCR 实验最后一步为产物分析,通常为琼脂糖凝胶电泳分析,还包括PCR-ELISA 分析、测序分析、杂交分析等。
从图4 中我们可以看出,PCR 实验的各个步骤均需使用移液器,建议每个步骤配备专用移液器,最好能够配合带滤芯吸头进行移液工作,有效防止气溶胶污染。
<hr/>了解更多PCR实验技巧,关注我们,后续将更新系列视频↓

Eppendorf实验室
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发表于 2024-9-20 20:07 | 显示全部楼层
PCR的原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
PCR最有价值的应用领域就是对感染疾病的诊断。理论上,只要样本有一个病原体存在,PCR就可以检测到。
在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。扩展资料
标准的PCR过程分为三步:
1、DNA变性:(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。
2、退火:(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3、延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。
有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
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发表于 2024-9-20 20:07 | 显示全部楼层
可以去看一下研究pfu 或者Taq DNA聚合酶的硕博士论文,里面会有详细的原理及原理图,论文可从知网下载!
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