实验笔记丨流式细胞仪样品制备的步骤详解和注意事项

大v

流式细胞仪（flow cytometry，FCM）是集激光设备、电子信息技术、光学精确测量技术性、电子信息技术及其体细胞莹光技术性、单克隆抗体技术性为一体化的新式新科技仪器设备，具备敏感度高、可重复性好、非特异强、方式灵便、剖析更快等优势，是当代最先进的细胞定量分析技术，广泛应用于生物医学领域，而熟练掌握流式细胞仪样品制备技术是正确使用该仪器的先决条件。
在典型的流式细胞术样品制备中，磷酸盐缓冲液 (PBS) 是一种常见的悬浮缓冲液，流式细胞术最直接的样品包括来自培养物、细菌、酵母、血液和组织的非贴壁细胞。对于细胞培养，细胞的生长速度最好是105 –107个细胞/ml，以防止流式细胞仪堵塞，分选速度约为2,000–20,000个细胞/秒。对于血液，通常通过简单的裂解步骤去除红细胞；然后通过它们的FSC/SSC特征快速识别淋巴细胞、粒细胞和单核细胞。对于实体组织，例如肝脏或肿瘤，为了产生单细胞，实体材料必须通过机械或酶促分解。机械分解包括将切碎的组织悬浮液通过细针数次，然后根据需要进行研磨和超声处理。


酶用于破坏蛋白质-蛋白质相互作用和将细胞结合在一起的细胞外基质。它们的作用取决于包括pH值、温度和辅助因素在内的因素，因此在选择酶时要小心。

为了通过流式细胞术研究细胞内成分，例如细胞因子，细胞的质膜必须被通透以允许染料或抗体分子通过，同时保持细胞的整体完整性。最好是用低浓度（最高 0.1%）的非离子去污剂如皂苷。总之，样品制备方法将取决于起始材料和表位的性质。

1. 细胞的制备

(a) 储存在液氮中的细胞

1 制备 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）。

2 小心地从液氮储存中取出细胞。

3 使用 PBS/BSA 缓冲液快速解冻并放入 15 ml 锥形离心管中。

4 以 400 g 离心 5 分钟。

5 弃去上清液，用适量的 PBS/BSA 缓冲液重悬沉淀。

(b) 悬浮组织培养细胞系

1 制备 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）。

2 将组织培养瓶中的细胞倒入 15 ml 锥形离心管中。

3 以 400 g 离心 5 分钟。

4 弃去上清液，将沉淀重悬于 10 ml PBS/BSA 中。

5 以 400 g 离心 5 分钟。

6 弃去上清液，用适量的 PBS/BSA 重悬沉淀。

(c) 贴壁组织培养细胞系

1 制备 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）。

2 使用 2 ml PBS/BSA 缓冲液轻轻刮取细胞。

3 将细胞转移到 15 ml 锥形管中，并添加最多 10 ml 的缓冲液。

4 以 400 g 离心 5 分钟。

5 弃去上清液并将沉淀重悬于新鲜的 PBS/BSA (10 ml) 中。

6 以 400 g 离心 5 分钟。

7 弃去上清液，用适量的 PBS/BSA 缓冲液重悬沉淀。

(d) 从实体/淋巴组织制备细胞

1 将组织放在无菌培养皿上。使用含有约 15 ml PBS/BSA（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）的注射器和针头轻轻灌注组织，去除细胞。

2 将培养皿中的细胞悬液转移到 15 ml 锥形离心管中。

3 以 400 g 离心 5 分钟。

4 弃去上清液，将沉淀重悬于 PBS/BSA 中。

5 加入 10 ml 氯化铵裂解缓冲液。

6 混合并孵育 2 分钟，不要超过这个时间。

7 以 400 g 离心 5 分钟。

8 加入 10 毫升 PBS/BSA 并混合。

9 再次以 400 g 离心 5 分钟。

10 弃去上清液，用 PBS/BSA 重悬沉淀至终体积为 10 ml。

11 使用血细胞计数器计数细胞。

12 如有必要，调整细胞悬液，使最终计数为 0.7–1.2×107 个细胞/ml。

2. 细胞和血液的直接免疫荧光染色

该技术适用于荧光染料与一抗直接连接的情况，例如 PE、FITC 和 Alexa Fluor® 偶联物。

1 适当准备细胞（参见第 1 节）。用 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）将细胞悬液调整到 1 × 106 个细胞/ml 的浓度。

[全血样本可以未经稀释使用，除非细胞计数很高，例如白血病。EDTA 和肝素是首选的抗凝剂]。

2 将 100 μl 细胞悬液 [全血] 分装到所需数量的试管中。

3 以推荐的稀释度添加抗体。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。

4 用 2 ml PBS/BSA 洗涤细胞，以 400 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

[向血液悬浮液中加入新鲜制备的红细胞裂解缓冲液，例如 2 ml AbD Serotec's Erythrolyse，并充分混合。在室温下孵育 10 分钟。400 g 离心 5 分钟，弃去上清液]。如果需要，将细胞重悬于 0.2 ml PBS/BSA 或 0.2 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS/BSA 中。通过流式细胞仪获取数据。

3. 细胞和血液的间接免疫荧光染色

该技术适用于使用未偶联或生物素偶联的单克隆和多克隆抗体的情况。必须使用二级试剂来显示一抗，例如在生物素的情况下使用抗生物素蛋白。

1 适当准备细胞（参见第 1 节）。用 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）将细胞悬液调整到 1 × 106 个细胞/ml 的浓度。

[全血样本可以未经稀释使用，除非细胞计数很高，例如白血病。EDTA 和肝素是首选的抗凝剂]。

2 将 100 μl 细胞悬液 [全血] 分装到所需数量的试管中。

3 以推荐的稀释度添加一抗。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。

4 加入 2 ml PBS/BSA 缓冲液，以 400 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

5 以推荐的稀释度添加适当的二级试剂。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。

6 用 2 ml PBS/BSA 洗涤细胞，400 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

[向血液悬浮液中加入新鲜制备的红细胞裂解缓冲液，例如 2 ml AbD Serotec's Erythrolyse，并充分混合。在室温下孵育 10 分钟。400 g 离心 5 分钟，弃去上清液]。

7 如果需要，将细胞重悬于 0.2 ml PBS/BSA 或 0.2 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS/BSA 中。

8 通过流式细胞仪采集数据。

4. 染色全血中的 lambda 和 kappa 链

该方法应与识别人κ和λ免疫球蛋白轻链的直接偶联双色试剂一起使用。检测特定于 B 淋巴细胞上的免疫球蛋白表达需要一个程序来去除血清免疫球蛋白，否则会引起干扰。

1 在抗凝剂中采集血液，例如 EDTA、肝素或酸性柠檬酸葡萄糖。

2 将 2–3 ml 全血分装到 25 ml 通用容器中。然后加入 20–25 ml PBS/BSA（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA），预热至 37°C，并充分混合。

3 以 400 g 离心 5 分钟。小心吸出上清液，注意不要干扰细胞沉淀。将沉淀重悬在残留的上清液中。

4 重复洗涤（步骤 2 和 3）两次。

5 将 100 μl 清洗过的血液分装到所需数量的试管中。以推荐的稀释度添加抗体（参见具体数据表）。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。

6 添加红细胞裂解缓冲液，例如 2 ml AbD Serotec's Erythrolyse 并充分混合。在室温下孵育 10 分钟。400 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

7 用 2 ml PBS/BSA 洗涤细胞，以 400 g 离心 5 分钟并弃去上清液。

8 如果需要，将细胞重悬于 0.2 ml PBS/BSA 或 0.2 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS 中。

9 通过流式细胞仪采集数据。

5. 用于分析细胞内细胞因子的全血方案

这是一种通过流式细胞仪分析细胞内细胞因子的快速而简单的方法。可用于分析小样本，并避免在通过密度梯度离心分离外周血细胞期间产生人为影响的干扰。所描述的刺激条件适用于 IFN γ、IL-2 和 TNF α。其他细胞因子可能需要不同的条件。该过程需要试剂盒来固定和通透细胞，其中我们推荐 Leucoperm T M。所有血样必须收集到肝素抗凝剂中。EDTA 会干扰细胞刺激过程，因此应避免使用。

1 将 0.5 ml 血液分别分装到 2 个试管中，然后在每个样本中加入 0.5 ml 细胞培养基（不含任何添加剂）。

2 向一个试管（静息种群）中加入莫能菌素，使其终浓度为 3 mM。

3 向另一个试管（活化细胞）中加入 PMA、离子霉素和莫能菌素，最终浓度分别为 10 ng/ml、2 mM 和 3 mM。

4 在 37°C 和 5% CO2 的气氛中孵育 2–4 小时。

5 在孵育期结束时，将 100 μl 样品等分到适当数量的试管中。

6 在此阶段添加细胞表面抗体（如果您的实验需要）并孵育 15 分钟。

7 每管加入 100 μl LeucopermTM Reagent A 并孵育 15 分钟。该试剂将细胞固定在悬浮液中。

8 用含有 0.1% 叠氮化钠和 1% BSA 的 PBS 洗涤两次。

9 添加 100 μl LeucopermTM Reagent B（渗透细胞）和所需的抗细胞因子抗体。

10 孵育 20 分钟。

11 使用 PBS 缓冲液洗涤两次，并通过流式细胞仪进行分析。

6. 细胞内抗原的直接染色

细胞内抗原的检测需要在染色前进行细胞通透步骤。

1 收获细胞并确定存在的总数。

2 在洗涤缓冲液（含有 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS）中洗涤两次。

3 如果需要，在此阶段使用适当的直接偶联单克隆抗体对细胞表面抗原进行染色。染色后，在 PBS 中洗涤细胞一次并丢弃上清液。

4 每 1 × 106 个细胞使用 100 μl在 Leucoperm T M Reagent A（细胞固定剂）中重悬细胞。在室温下孵育 15 分钟。

5 在洗涤缓冲液中洗涤一次。

6 每 1 × 106 个细胞使用 50 μl在 Leucoperm T M Reagent B（细胞通透剂）中重悬细胞。

7 将 50 μl 细胞悬液分装到所需数量的含有直接偶联抗体的试管中。在室温下孵育 30 分钟。

8 在洗涤缓冲液中洗涤一次，然后重悬于 0.25 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS 溶液中。

9 在 4°C 下储存，直到在流式细胞仪上采集，最好在 24 小时内。

7. 细胞内抗原直接染色：甲醇法

甲醇修饰特别适用于检测一些核抗原，如PCNA和Ki-67。藻红蛋白偶联物不适用于使用这种方法检测细胞表面抗原。

1 收获细胞并确定其总数。

2 在洗涤缓冲液（含有 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS）中洗涤两次。

3. 如果需要，在此阶段使用适当的直接偶联单克隆抗体对细胞表面抗原进行染色。染色后，在 PBS 中洗涤细胞一次并丢弃上清液。

4 每 1 × 106 个细胞用 100 μl 重悬细胞在冷 (2–8°C) LeucopermTM Reagent A中。在 2–8°C 下孵育 10 分钟。

5 加入 500 μl 冷无水甲醇，涡旋并在 2–8°C 下孵育 10 分钟。

6 在洗涤缓冲液中洗涤一次。

7 每 1 × 106 个细胞使用 100 μl 在 LeucopermTM 试剂 B 中重悬细胞。

8 将 50 μl 细胞悬液分装到所需数量的含有直接偶联抗体的试管中。在室温下孵育 30 分钟。

9 在洗涤缓冲液中洗涤一次，然后在 0.25 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS 溶液中重悬。

10 在 4°C 下储存，直到在流式细胞仪上采集，最好在 24 小时内。

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