「基因编辑」到底是什么，应当如何合理地应用这种技术？

乔帮主

「基因编辑」到底是什么，应当如何合理地应用这种技术？
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以下是基因编辑细胞的操作：通过病毒法，化学转染法或电转法将gRNA和Cas9转入细胞中，根据转染方法不同进行不同时长的药筛，药筛完成后挑选
单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。

检验医师

基因组编辑（也称基因编辑）是能够改变有机体 DNA 的一组技术。这一组技术能够使科学家在基因组特定部位增加、移动或改变遗传物质。

今后也许人们可以利用基因编辑技术培养出不会叮咬人的蚊子，不长象牙的大象，不长角的犀牛，能制造蛋白质、药物、疫苗或燃油的细菌，以及复活那些已经绝灭的动植物。


2018 年 11 月 26 日，南方科技大学副教授贺建奎宣布一对名为露露和娜娜的基因编辑婴儿于 11 月在中国健康诞生，由于这对双胞胎的一个基因经过修改，她们出生后即能天然抵抗艾滋病病毒 HIV。这一消息迅速激起轩然大波，震动了中国和世界。
基因组编辑（也称基因编辑）是能够改变有机体 DNA 的一组技术。这一组技术能够使科学家在基因组特定部位增加、移动或改变遗传物质。其中 CRISPR-Cas9 是迄今为止最为有效、低廉和容易的方法。
用通俗的话来说，CRISPR-Cas9 是一把分子剪刀。如果我们把基因组当作一本充满数百万字的遗传密码，那么 CRISPR-Cas9 就可看作是用来插入或删除字（基因）甚至改变单个字的有效工具。
科技含量如此高的基因工具，为何会将事件中的当事人推到了伦理和法律的风头浪尖呢？我们还得从基因编辑技术的应用说起。
基因编辑技术的应用激动人心

基因编辑技术的可能应用范围。基因编辑技术自 2002 年以来广泛应用于人、细菌、斑马鱼、线虫、植物、热带爪蟾、酵母、果蝇、猴、兔、猪、大鼠和小鼠。最近的激动人心的发展是使用 dCas9 版的 CRISPR/Cas9 于转录调节的靶蛋白结构域、表观基因修饰以及特定基因组位点的显微可視化。还可利用此技术更好地建立动物模型，以了解疾病病因发病机制，增进基本知识，开发新药物。
目前，基因编辑技术应用涉及以下 5 个方面。
治疗：如果研究开发以及临床转化的策略合适，进展顺利，有可能通过修饰体细胞，治疗个体自身遗传病（例如地中海贫血）、治疗和预防个体自身基因引起的疾病（例如 BRCA 基因发生突变引起乳腺癌和卵巢癌）、治疗和预防个体自身感染艾滋病病毒（将插入细胞核内的 DNA 艾滋病病毒删除）。
预防：如果方法合适和进展顺利，有可能通过生殖系（卵、精子、合子、胚胎）基因修饰使后代不得该家族的遗传病或其他与基因有关的疾病，预防各种烈性传染病、预防癌症、心血管疾病、预防药物依赖等。
增强：增强是人获得超越人类具有的性状和能力。因此增强不是一般意义上的而改进。例如人类奔跑速度极限是每小时 44 公里，而非洲猎豹是每小时 100 公里，最快的骏马可达 88 公里，连家猫也可以达到 48 公里。在 44 公里的极限内我们可以通过训练提高一下我们的速度，这是「改进」，不是「增强」；如果我们用某种特殊办法使我们的奔跑速度提高到每小时 50 公里，那就是「增强」了，因为这超过了人类的极限。
增强可有两种目的：其一为医学目的，例如人本来不能抵御逆转录病毒（艾滋病），通过基因修饰使人获得预防艾滋病病毒感染的能力，再比方说，人类寿命原则上至多到 150 岁，可将长寿动物基因添加在人类基因组内，可以活到超过 150 岁。其二为非医学目的，例如使人具备猫的夜视能力；或改变皮肤、头发、瞳孔颜色；拔高身高；加快奔跑速度等。也许今后的父母可以根据他们的愿望和爱好，利用基因编辑技术，剔除一些引起他们不喜欢的性状的基因，插入一些从其他机体取来或合成的可产生他们喜欢的性状的基因，来设计制造孩子。
用于异种移植：例如敲掉猪体内在人体引起免疫反应的基因；删除猪体内若干逆转录病毒等，这样将猪器官移植至人体内不致引起免疫反应和跨物种感染。
基因编辑技术在非人生物体的应用：基因编辑技术几乎可以用于任何生物体。今后也许人们可以利用基因编辑技术培养出不会叮咬人的蚊子，不长象牙的大象，不长角的犀牛，能制造蛋白质、药物、疫苗或燃油的细菌，以及复活那些已经绝灭的动植物。
基因组编辑婴儿事件中当事人错在哪里？

首先，当事人所做的是为了增强目的而对生殖系（胚胎）基因组进行编辑。在目前基因组编辑技术的应用范围中，增强最缺乏伦理上的可辩护性。如果我们根据将基因组编辑这项技术用于什么对象以及为了什么目的，可以列出如下一个矩阵：


随着数字的增加，基因编辑这种干预产生的风险和受益的不确定性、未知因素和复杂性也随之增加。
目前利用体细胞的基因组编辑来治疗病人的遗传病，已经证明是安全和有效的，因此在伦理学上的可辩护性和可接受性为 1。在体细胞基因编辑的安全性和有效性上已经建立了一套有效的监管制度，基因编辑的上述缺点得到纠正，优点得到进一步发挥。动物研究证明对生殖系基因编辑是安全和有效的，而且公众也表示同意（因为生殖系基因编辑要改变人类的基因池），那么为了预防就那些生殖系基因组编辑在伦理学上也可得到辩护性和接受性，因此数字为 2。
目前如果将基因编辑用于增强，产生的风险和受益的不确定性、未知因素和复杂性太多，无法保证干预的风险-受益比会有利于未来的孩子和后代，因此目前不考虑将基因编辑用于增强，不管是医学目的的增强，还是非医学目的的增强。

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继续前进

博主你好！
基因编辑技术目前应用范围最广的是第三代基因编辑技术（Crispr/Cas9）。
这种基因编辑技术目前实验室已经广泛的在进行研究了。临床级别的研究目前也是在少量进行中。
下面我们来看看他的作业原理：他的工作原理是可以将某段我们不需要的基因序列（碱基长度）进行删减，比如对于一些突变（通常指不良的突变）会诱发病症的进行删除，从而做到修复基因序列的目的。
我们实验室目前正在做一个关于在骨髓干细胞中利用Crispr Cas9技术修正某几个突变点从而寻求解决疼痛/痒/关节问题的案例。
此类技术的应用非常广泛，可以说具备治疗甚至治愈任何由于基因突变诱发的各类疾病。
希望这些简单讲解可以给您带来帮助。

检验医师

放射性辐射既然可以破坏基因链，那么是否有一种辐射可以提取基因链，再将基因链加入被破坏的那段基因中，实现基因上的变异。

例如，辐射光线辐射到一只蝙蝠之后，立刻将带有辐射基因的光线辐射到人体，这样人类便拥有了蝙蝠的基因。

或许这是一种野蛮粗暴的基因重组方法。

基因技术的目的
1. 让人类获得更强壮的力量。
2. 获得生命的延长
3. 拥有更好的身体
4. 解决被病痛的烦恼（近视，癌症，疾病，人体缺陷）
5. 拥有再生的能力
6. 动物的夜视能力

生物学认为，人体再生的时候需要消耗很多能量。（能量从哪来？）（利用蛋白质的损耗去弥补缺少的组织？）

受伤之后，血液不会流失，伤口自动愈合，细胞自动修复。

倘若用基因重组制造出非人非兽的怪物，那怪物又该如何去生存。

吃风饮露长肌肉？不仅要变异，还要修仙？有点难为基因重组了吧。

往好的方面想，强大的人类更加适合生存。

卡卡

为了更好的理解基因编辑，我们先补充一些最基础的遗传学知识和背景。

19世纪末，孟德尔对豌豆杂交试验的后代进行观察和统计分析，发现了基因的分离定律和自由组合定律，开创了遗传学。
1910年以后，摩尔根又以果蝇为实验材料，分析遗传连锁现象，证明基因在染色体上呈线性排列，提出了遗传连锁定律，进一步发展为细胞遗传学。
1941年，比德尔以红色面包霉为材料，进行生理生化功能研究，发现基因通过酶起作用，提出“一个基因一个酶”的理论。
20世纪50年代前后，格里菲斯通过肺炎双球菌转化实验，赫尔希和蔡斯通过噬菌体侵染细菌实验，证明了遗传物质为DNA而非蛋白质。
1953年，沃森和克里克通过分析DNA的X射线衍射图谱，提出DNA分子双螺旋结构模型，遗传学进入分子遗传学时代。
20世纪70年代末就有研究组发现，外源DNA可以被酵母或细菌吸收并随机整合到基因组中。随后的工作表明，这个过程也可以以一种有针对性的方式发生，将DNA微注射到细胞核中可以刺激细胞同源重组，从而实现有针对性的基因组修饰。

DNA缠绕在组蛋白上形成核小体，经过缠绕折叠变得密集，形成染色体。染色质和染色体是同种物质在不同细胞时期下的不同状态，分裂期染色质浓缩成棒状染色体以便于分派到子细胞中。

现在我们知道，生物的性状（形态特征和生理生化特性）由基因决定，受环境影响，基因是染色体上具有遗传效应的DNA片段。DNA片段中的遗传信息蕴含在DNA链上A、T、C、G四种碱基的排列顺序中。
我们还知道，基因的表达遵从中心法则，从DNA转录得到mRNA，mRNA翻译得到蛋白质，蛋白质直接体现性状。转录遵循碱基互补配对原则，翻译时三个碱基是一个密码子，决定一个氨基酸。
那么，生物表现出的种种性状，最终还是由染色体上的DNA序列决定的。因此，DNA序列中的一些变化（插入、缺失、替换等）就可能造成表型的变化，引发代谢障碍，甚至引发疾病。



(A)，人类22号染色体包含48 x 10^6对核苷酸，约占人类基因组的1.5%。(B)，22号染色体的一部分，大约有40个基因。深棕色的是已知基因，红色的是预测基因，灰色是基因间序列。(C)，B中显示四个基因的扩大部分。(D)，典型基因的内含子-外显子排列结构，黄色是表达调控区域，红色是外显子，灰色是内含子。

<hr/>了解了上述背景，我们就可以开始讨论基因编辑啦，先说基因编辑是什么。
官方一点的说法，基因编辑，就是对目标基因及其转录产物进行编辑（定向改造），实现特定DNA片段的加入、删除，特定DNA碱基的缺失、替换等，以改变目的基因或调控元件的序列、表达量或功能。基本原理是通过序列特异性的DNA结合结构域和非特异性的DNA修饰结构域组合而成的序列特异性核酸内切酶，识别染色体上的DNA靶位点，进行切割并产生DNA双链断裂，诱导DNA的损伤修复，从而实现对指定基因组的定向编辑。
简单来说，基因编辑就是利用一个蛋白或融合蛋白作DNA分子的手术刀对目的基因进行改造。该蛋白的一部分结构可以识别/结合你要编辑DNA的特定区域（这样才能把手术刀带到需要改造的基因那里），一部分结构可以对DNA进行操作（发挥手术刀的功能，定点定向改造）。
因此，为了实现特定基因的编辑，首先要在该基因内选择适合的靶点（适合被识别、切割），然后要把酶（负责切割DNA或者替换碱基）带到这个基因的靶DNA区域，之后酶就能引起双链断裂或碱基替换等……
<hr/>这里，我们再介绍几种包括CRISPR在内的技术手段，讨论如何实现基因编辑。
1. Cre-lox 介导的基因组特定位点重组

Cre-lox 重组技术源自大肠杆菌的P1噬菌体，目前被广泛用于特异位点的基因敲除、插入、翻转和基因易位，从基因水平对生物体进行定向遗传改造，特别是在小鼠转基因中，能提供复杂的基因表达时空控制。该系统由两个来自P1噬菌体的成分组成：Cre重组酶和loxP识别位点。
Cre重组酶特异性识别 loxP位点，并负责分子内和分子间的重组，只要基因组中含有loxP位点，在细胞中表达Cre酶就能使该位点发生DNA重组，进而实现lox位点的定点编辑。



Cre酶和lox位点

Cre酶由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点。Cre酶可以单独作用，独立于其他辅助蛋白或辅助因子。
LoxP 是34对的碱基识别序列，由两个13 bp长的回文重复序列组成，中间由8 bp非对称间隔序列分隔。核心序列中的不对称使loxP站点具有方向性，除了P1噬菌体外，loxP序列在任何其他已知基因组中都不是自然发生的，而且它的长度足够长，几乎不可能随机发生。
因此，如果我们人为在基因组加入loxP位点后，一旦有Cre重组酶，便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随后，loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下，切口在DNA连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于loxP位点的位置和方向。主要存在几下几种重组方式：



1，两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列； 2，两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转； 3，两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位。

该系统具有以下优点：简约高效、特异性强、应用广泛、可控的时空特异性。已成功用于功能基因的激活、转基因筛选表及的删除、基因的定点整合等。缺点是只能在固定位置插入或删除基因，不能实现对基因组中任意基因的编辑，操作受限。



Cre-loxP重组系统在转基因中的应用

2. 锌指核酸内切酶 Zinc figer nucleases 定向修饰靶基因

锌指核酸内切酶 (ZFNs) 是人工设计的含有两个功能结构域的蛋白核酸内切酶，包括 Fok I 切割结构域 和 重复锌指结构组成的DNA识别结构域。每一个锌指结构可以特异地识别 3个核酸，6 个锌指结构就可以特异地识别 18 个核酸，从而决定了识别位点的特异性。核酸内切酶 Fok I 必须形成二聚体才能够将 DNA 双链剪开，因此要在目的位点左右两端都设计锌指酶。



锌指核酸内切酶造成双链DNA断裂示意图

锌指核酸内切酶 将DNA双链剪开形成双链缺口，修复该缺口有两种方式：可能造成DNA缺失/插入的易错非同源末端连接 或 保守的同源修复。非同源末端连接容易形成移码突变，过早的形成终止密码子，从而造成基因敲除。保守的同源修复常规状态下会将缺口恢复如初，如果人为转入两端连有缺口同源臂的外源基因，那么就有机会将该外源基因插入到缺口中，形成基因敲入。



锌指核酸内切酶介导的基因组修饰途径

锌指酶基因修饰具有以下优点： 定向高效，定点精确，可以在基因组范围内实现定点敲入/敲除。缺点是锌指酶识别的目标序列长度是一定的，所以某些基因包括一些小基因和同源性高的基因，不可以被敲除，大片段基因难以通过锌指酶技术敲入。此外，锌指酶具有一定的潜在脱靶效应 。另外，由于ZFN的合成时间长，装配过程非模块化，其实用性也受到了限制。
3. 类转录激活因子效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease) 定向修饰靶基因

类转录激活因子效应物核酸酶 (TALENs) 由来自于植物病原菌黄单孢菌的类转录激活因子效应因子 TALEs 和 核酸内切酶 Fok I 的催化区域融合而成。高度保守的33～35个氨基酸TALEs重复组件决定了TALEs结合DNA的识别特异性。TALENs 性质与锌指核酸内切酶相似，识别特异的DNA序列，将其剪切形成双链缺口，通过同源修复或非同源末端连接修复，造成了基因插入或缺失。



在 TALEs 中，被 称 为 repeat variable di-residues( RVD) 的 12 和 13 位相邻的两个氨基酸决定了识别的位点 。天冬酰胺和异亮氨酸识别 A，天冬氨酸和组氨酸识别 C，天冬酰胺和甘氨酸酸识别 T，两个天冬酰胺识别 G 。

TALENs 于2011年首次报道，代表了基因组工程的巨大进步。 一位经验丰富的科学家六周才能制作ZFN，但新手可以在短短几天内制作一个TALEN！TALENs 的可定制DNA结合特性还使得定制转录因子的设计能够调节基因表达。TALENs 和 ZFN 相比，操作简便，而且TALENs 的识别位点更广泛，几乎可以敲除所有的基因，TALENs 的剪切效率比ZFN高。
4. 如日中天的 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 系统

CRISPR 近年来很火，大家也都比较熟悉了，它的中文翻译很绕口，叫“成簇排列的有规律间隔的短回文重复序列”，CRISPR/Cas系统作为细菌的获得性免疫，用于抵御噬菌体入侵。
简单来说，Cas9就像限制性核酸内切酶一样，能够切割DNA。不同的是，绝大多数限制性核酸内切酶识别固定的DNA序列，而Cas9对DNA的识别需要一个sgRNA与靶DNA配对，切割需要靶DNA上的PAM序列。crRNA跟哪个DNA配对，就能把Cas9领到那里，Cas9识别PAM并对DNA进行切割。当然，也可以将Cas9的切割结构域突变掉，融合表达胞嘧啶脱氨酶之类的碱基改造酶类，就可以实现碱基的定点替换。



与靶DNA配对的是spacer（外来DNA上截下来的记忆片段）转录并加工出的crRNA，tracerRNA作支架与crRNA一起结合Cas9，对靶DNA进行切割。为了操作方便，提高效率，科学家们把crRNA和tracerRNA融合到一起，称作single guide RNA，即sgRNA。

因此，如果我想编辑一个基因，首先要选择这个基因上的PAM位点附近作靶点，然后设计sgRNA，在细胞表达sgRNA和Cas9，就可以将目的片段剪切形成双链缺口，通过同源修复或非同源末端连接修复，造成了基因插入或缺失。如果同时转入有同源臂的外源基因，那么就有机会将该外源基因插入到缺口中，形成基因敲入。
CRISPR技术的优点是，能够实现定点编辑，可一次性敲除多个基因，适用对象广泛，使用简单，成本低。缺点是切割受靶DNA上的PAM限制，偶有脱靶。

考虑到CRISPR的应用越来越广泛，其原理和操作也相对简单，这里我们就展开介绍一下，不想深入了解的小伙伴可以跳过，直接看小结。
细菌通过以下两步描述 CRISPR 发挥二次免疫：
（1） 获得 spacer 记忆，在 Cas1 和 Cas2 及 Csn2 蛋白的作用下， 细菌识别入侵核酸并扫描外源DNA潜在的PAM，将临近 PAM 的序列作为候选spacer，然后在CRISPR基因座的 5'端合成repeats；最后新的spacer整合到两个repeat之间，CRISPR基因座中的spacer从5'到3'的排列记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。



初次侵染后，拥有CRISPR/Cas系统的细菌会截取噬菌体DNA的一部分作为间隔序列，储存在自己基因组上规律存在的重复序列之间，作为记忆。细菌再次被同种噬菌体侵染时，之前保留的记忆（截下来的DNA）会转录出crRNA，这个RNA可以与tracerRNA一起结合Cas9，去配对并靶向降解外来的噬菌体DNA，预防侵染。

（2） 发挥免疫功能，发挥免疫的过程可以再划分为两步：① CRISPR表达盒内基因的表达，CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，在Cas蛋白或核酸内切酶的作用下被剪切成一些成熟的小RNA单元称crRNA，TypeⅡ型 CRISPR/Cas系统还需要tracrRNA的指导。②基因表达产物组装，切断外源DNA。成熟的crRNA与特异的Cas蛋白形成复合物，再与外源DNA结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA的spacer与靶序列互补配对，外源 DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。



类似于人的免疫反应，CRISPR免疫也有初次免疫和二次免疫之分（虽然大家不这么说） ：初次免疫即噬菌体DNA侵入，细菌对外源基因截取作为spacer保存在repeats中；再次免疫即细菌的基因组中已经含有了该噬菌体对应的spacer，CRISPR系统快速降解入侵DNA的过程。

在CRISPR/Cas系统的作用机制被揭示清楚后，科学家们认识到其可能具有巨大的应用前景。基于以前ZFN及TALEN编辑技术的应用范围，人们推测 CRISPR/Cas系统也可能在其他的真核生物中工作。基于第二类 CRISPR，人们开发了 CRISPR/Cas9 系统用于基因编辑，实验结果证明将 tracerRNA 与 crRNA 用一个小片段连接成为 sgRNA 后，不影响该系统正常工作且打靶效率有所提高，后来常规的表达策略就将 sgRNA 与 Cas9 整合到一个表达载体上。



CRISPR/Cas9 用于真核生物基因敲除示意图。表达的Cas9蛋白在核定位信号的引导下进入细胞核，Cas9结合sgRNA后识别染色体上特定DNA区段，由Cas9的切割结构域造成DNA双链断裂。

CRISPR/Cas9 系统在真核生物中的打靶效率受到靶位点染色体状态的影响，要让 Cas9 蛋白高效地转运到哺乳动物细胞核内，需在 Cas9 蛋白的N端或C端加上真核细胞的核定位信号(NLS)。Cas9 蛋白在折叠过程中对临近的NLS功能有一定“遮蔽”作用，N 端核定位信号和Cas9 蛋白之间要加上32个氨基酸残基的接头才能发挥功能，在 Cas9 蛋白的C端添加核定位信号似乎更有效。
关于CRISPR的一些问题
1，细菌天然 CRISPR 如何避免自身免疫 成熟的crRNA除spacer外，其5'端和3'端含有部分repeat序列，当外源DNA入侵时，crRNA 两端序列不能与靶位点配对，对于自己CRISPR盒子中的相同序列，crRNA与两端的repeat序列也能完全配对，实际上只有不完全的配对才允许核糖核蛋白复合体发挥切割活性。与细菌整合进CRISPR盒的spacer对应的噬菌体片段被称为protospacer，其5'或是 3'端相隔1-4bp，有一个长为2-5bp的相对保守序列，该序列被称为PAM。在细菌CRISPR盒子里的spacer没有PAM，这样CRISPR发挥免疫的时候就不会切掉自己，也就避免了细菌的自身免疫。
2，免疫的有效性, 并不是每种细菌只含一类 CRISPR 系统，也有些同时拥有两类或三类，这是细菌与病毒共同进化的结果，但这并不说明CRISPR总是有效的。噬菌体的基因也有变异，很多发生了点突变的噬菌体DNA就无法被先前的记忆(spacer)所识别，这就发生了“免疫逃逸” 。
3，靶 DNA 怎么被切开的 CRISPR/Cas 系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，切割特异性主要依赖于识别靶序列上的PAM以及protospacer。Cas9蛋白存在HNH和RuvC两个活性位点，可分别切割与crRNA互补的DNA链和非互补链，切割位点位于PAM上游3nt处，RuvC-like结构域可以对另一条链进行切割，切点于PAM上游3-8nt处，切割后形成双链断裂(DSBs)。
4，切开以后的 DNA 会怎样 DNA损伤后产生的DSBs激活细胞内固有的损伤修复。不存在修复模板时，NHEJ用于双链断裂的连接，造成插入/缺失(indel)突变；HDR通过模板进行同源修复，可将序列复制到双链断裂处，将特定的核苷酸或片段引入目标基因。
5，脱靶 前人发现最多5个碱基存在错配情况时，系统仍会对该位点进行切割，造成脱靶。研究表明，CRISPR/Cas 系统在细菌中是特异的，在水稻中特异性也很高。而 CRISPR/Cpf1 系统应用于基因组精确编辑几乎不存在脱靶效应。
<hr/>划重点

Cre-lox系统中，cre酶特异性识别lox位点，将“手术刀”带到特定DNA区域，通过cre酶的DNA重组活性进行操作。
锌指核酸内切酶 (ZFNs) 系统中，串联的锌指结构识别基因组中对应的DNA位点，想操作哪里的DNA，就根据那里的DNA序列设计串联锌指，将“手术刀”带到特定DNA区域。锌指核酸内切酶 (ZFNs) 通过Fox I 的DNA内切酶活性进行操作。
类转录激活因子效应物核酸酶 (TALENs) 系统中，类转录激活因子效应因子识别基因组中对应的DNA位点，将“手术刀”带到特定DNA区域，而后通过Fox I 的DNA内切酶活性进行操作。TALENs 比 ZFN 设计简便，识别位点广，剪切效率高。
CRISPR/Cas系统中，sgRNA配对识别基因组中对应的DNA位点，将“手术刀”带到特定DNA区域，而后Cas9识别该区域附近DNA上的PAM，通过Cas9的DNA内切酶活性切割DNA。
所有这些编辑技术用于敲除时，都只是切割DNA，产生双链断裂。编辑结果是细胞对DNA双链断裂的错误修复造成的。
<hr/>如何对待基因编辑

对于基因编辑用于动植物育种，我一直都是很支持的。它跟转基因也有本质区别，肯定会更早投入生产应用。
对动植物的基因编辑，最终产生的是对该物种自身基因的改变，基于自身基因的定向改造不涉及外来基因，这就和自然状态下的变异没有区别，产生的大片段缺失和X射线诱变育种的缺失没有区别，甚至因为更加精准而更安全可靠。
对于很多植物科学的研究成果，可以通过基因编辑，敲除、偏低或者碱基定向替换就可以快速投入生产的，如果基因编辑受到太多监管、约束和限制，这些研究成果的推广就会比较受限。因为自然状态下突变的低频性，不容易获得目标基因的突变，如果不同生态型该基因没什么变化，那就只能定向创造突变才能推广该成果。
比如，OsLCT1编码了一个负责将重金属Cd镉转向水稻籽粒的转运蛋白，我们敲除它就能降低水稻籽粒重金属含量。但是不同品种、亚种中该基因的自然变异差别极小，我们不能通过传统杂交、回交来实现该目标，只能通过基因编辑实现。如果限制基因编辑在作物育种中的应用，那么我们科研中的种种发现就很难推广到实际生产应用了。
<hr/>课后思考题

• 本文所述的四种基因编辑工具原理分别是什么，谁识别DNA，又是谁切割DNA？
  

2. 如果我想使用CRISPR技术，对一个目的基因进行敲除，我需要设计什么，注意什么？


参考文献

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科学网-Cre-loxP重组系统介绍
CRISPR三类系统的详细解读
基因敲入相比于基因敲除有哪些难点？