免疫荧光图片Merge，荧光强度统计PS+ImageJ

乔帮主

免疫荧光


PS图片处理：
Step.1 将图片拖入ps软件
Step.2 “command +M”调用"curve"功能，调节图片曝光程度
Step.3 然后根据图片的尺寸大小建立一个相同大小的画布，300 像素/英寸的清晰度；黑色背景。
Step.4 首先，在右下角把图层选项中“正常”改为“滤色”，然后将两组dapi和染色图层一同选上，右键进行“图层合并-merge”
Step.5 将图片的透明度调节至50%左右，并可以根据具体情况进行调节。
Step.6 然后根据之前选择好的curve参数调节两组图片。
谷歌图片处理：
设置参数-谷歌-20211029

target	Black	white
DAPI	5	200
VPS13C	20	253
GSTP1	5	180

Image J 处理荧光强度处理：
Step.1 导入图片
打开Image J，File→Open→打开要测量的图片。


Step.2 转换图片格式
Image→Type→16-bit（此步骤是将照片转换成为灰度图片，举例为16-bit，但实际可根据需要选择8-bit或32-bit）。


Step.3 设置测量参数
1.Analyze→Set Measurements；


2.在弹出的测量参数设置选项框中，勾选需要的测量参数：Area（所框选区域面积）；Mean（框选区域平均灰度值）；IntDen（Integrated Density）（框选区域荧光总强度），点击OK确认；IntDen=Area×Mean。
2.在弹出的测量参数设置选项框中，勾选需要的测量参数：Area（所框选区域面积）；Mean（框选区域平均灰度值）；IntDen（Integrated Density）（框选区域荧光总强度），点击OK确认；IntDen=Area×Mean。


Step.4 调出ROI Manager界面
1.Analyze→Tools→ROI Manger；


2.得到并框选Show All及Labels。


Step.5 在图片上选择测量对象（带荧光的细胞以及背景）并计算
1.点击主界面的套索工具；


2.选择第二步中转换格式的图片，用套索工具在图上勾画出一个荧光细胞轮廓后，在ROI Manager界面点击Add，在下ROI Manager左侧栏处会出现一个对象，点中后选择Rename，可以对该对象重命名，此处就先将其命名为a，点击确定OK；




3.按照步骤2继续用套索工具在照片上勾选出多个测量对象，并按照顺序以及目的重命名，这里就框选了4个细胞a、b、c、d，及两个背景对象A、B（在具体实验中框选细胞自然是多多益善）；


4.选中ROI Manager左侧栏第一个对象或最后一个对象，按住Shift，点击相对应的最后一个对象或第一个对象，即可对所有对象进行框选（如选中B后，Shift点击a）；


5.ROI Manager界面点击Measure，弹出如下所框选对象的数据。


Step.6 整理数据
1.Edit→Copy，可以将数据拷贝到Excel表中；



2.最后一列数据RawIntDen可以删去不需要（有些Image J软件不会出现该项数据），整理计算数据：修正IntDen-Area×Mean（背景）。


Step.7 按同样的操作步骤对另一张图进行分析
最后，分析结果如下：






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