western blot是为了什么？

临床医师

本人大一，刚进实验室，师兄简单讲了遍原理步骤就开始让我每周跑一次，我每次都是很机械的操作，想知道最后的图像能看出什么来?为什么要做wb?
原文地址：https://www.zhihu.com/question/43873463

卡卡

这篇内容的收藏越来越多了，发现大家都喜欢收藏但是不喜欢点赞，各位老铁们收藏的时候记得双击给我点个赞同啊~
<hr/>题主能提出这个问题，证明你真的很适合做科研，因为你不只是机械性做事，你还会思考。
但是你可以胆子再大一点，除了做实验，你还可以找师兄师姐多交流，同时自己多学习，这样在交流的时候不至于有太多的知识盲区。
关于western blot实验的原理（为什么要做这个实验），实验结果怎么看。以及做不出想要的结果该怎么办，这些问题你可以看下我今天的分享。

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western blot作为免疫学三大实验之一，是所有生物医药科研人必须要掌握的实验之一。
WB，是Western blotting的缩写，即蛋白质印迹法，又称免疫印迹（immunoblotting）,也就通过电泳技术分离不同组分，再采用印迹技术将蛋白质转移（“印”）到特定的膜上，再利用抗原-抗体的特异性结合原理，用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法，这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等方面。



WB由来

1975年，英国人Edwin Mellor Southern发明了基因组DNA特定序列定位的方法：将待测定DNA分子从琼脂糖凝胶中转移到一定的固相支持物硝酸纤维素膜（NC膜）上，即印迹（blotting），然后膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下杂交，检测特定DNA片段，并将这种方法命名为Southern印迹法；后来Alwine又用类似方法检测RNA，正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交；1981年Burette成功将对单向电泳分离后的蛋白质分子转印到膜上并进行免疫学分析（如抗体抗原特异性结合），这种印迹分析称为Western印迹法；而Eastern blotting是Western blotting的变形，只是检测对象变成了双向电泳后的蛋白质分子（所谓的双向电泳是等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF-PAGE）分离蛋白质）。

实验原理

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blotting先使用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）电泳分离出待检测的蛋白质，再用电场装置印迹至固相介质（如PVDF膜）上，固相介质以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。再以膜上的蛋白质片段作为抗原，与一抗（“探针”）特异性结合起免疫反应，再与酶或同位素标记标记的二抗结合，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

实验流程

SDS-PAGE凝胶电泳：（1）分离胶①配制：根据蛋白分子量大小确定合适的凝胶浓度后，可参考凝胶配置试剂盒中的说明书（如目标GFP蛋白为25kDa，采用8%-16%梯度浓度的胶），或自行参考文献配置。依次加入所需试剂于配胶专用烧杯中，轻轻并缓慢吹打胶溶液以混匀，用移液枪吸取液体和打出液体速度应至少保持在2-3s左右。注意：放液时不能全部放出，否则容易产生气泡，影响实验结果（有气泡的地方不导电）；配胶的APS需要在4℃的冰箱中保存；胶在加APS与TEMED促凝剂前一定要混匀其他组分。
电泳凝胶制备参考浓度
②灌胶：配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀就可开始灌胶。灌胶时，可用移液枪吸取胶沿玻璃板壁缓缓放出注入胶室，待胶面升到绿带中间线高度时即可。再次强调注意控制速度，避免气泡。然后加入适当剂量的纯水或无水乙醇以封胶，以盖住分离胶为准。③凝胶：在室温下开始凝胶30min。注意：凝胶过程中胶板应当保持稳定，不可晃动，否则导致分离胶液面不平。④倒压胶液：当压胶液和分离胶之间有一条折射线时，说明胶已大致凝固。再等大约3min，胶就充分凝固。此时将压胶液倒入废液缸，并用吸水纸伸入两板间的胶室将残留的压胶液吸干，但要注意别碰到分离胶表面。
（2）浓缩胶①配制：与分离胶操作一致，只是所需试剂不同。②灌胶：配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶。灌胶操作参考分离胶灌胶。③插样品梳：灌胶后立即将样品梳缓慢插入凝胶中，样品梳插入后应与胶板保持平行，不应倾斜。④凝胶：大约20min浓缩胶凝固，双手用食指与拇指捏住梳子，缓慢轻轻竖直向上拔出梳子，切记不要拔歪，保证齿口整齐。
（3）电泳将胶板放入电泳槽中，并加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，入足量的样品和合适的蛋白marker。电泳槽连接电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。注意不能让溴酚蓝跑出去。

转膜
转膜指的是把蛋白从凝胶转移至特定材质的膜上，我们本次采用PVDF膜，不同膜的性质不同，具体详情参考表2。依据胶的大小裁剪膜和滤纸6张，置于缓冲液中平衡10min。PVDF膜则需用纯甲醇浸泡湿润1-2s。采用“湿转移”，即把“三明治”黑板-海绵-3层滤纸-胶-膜(正面朝下，分清左右，与胶对应)-3层滤纸-海绵-白板依次放好，并完全浸入缓冲液中湿透操作（注意：黑色板的一面对黑色负极，湿转过程中不能干，轻轻用刮板赶走气泡）。湿转完成后，夹紧板放入湿转电转槽内，在转膜槽中加满电转液，插上电极（100V，1h），开始转膜。转膜槽置于有冰袋的泡沫箱中，保证电转一直处于低温下进行。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。




封闭与孵育
转膜之后迅速置于Tris-Buffered Saline(TBS)中，于回旋振荡器上室温下漂洗5min，以便移除残留的转移缓冲液。随后将膜用TBST从上向下浸湿后，转移至含有封闭液（TBST做溶剂，配5%脱脂牛奶）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h或4℃过夜封闭（PVDF膜在甲醇活化后是带电的，因而在转膜时会将蛋白吸附，所以封闭的目的就是要将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用奶粉填满，以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱）。一抗：加入合适稀释浓度的一抗（用TBST稀释），室温，脱色摇床孵育1h；TBST室温脱色摇床洗3次，每次10min（一抗只能结合能与其特异结合的蛋白，其他没有结合的就被洗下来了）二抗：加入合适稀释度（用TBST稀释）的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温，脱色摇床孵育1h；TBST室温脱色摇床洗4次，每次5min（二抗只能结合能与已结合蛋白的一抗结合，其他没有结合的就被洗下来了）

显色
辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法：用微量移液器取等体积的ECL试剂中的A、B发光液放在EP管中恢复至室温，按比例稀释混合。用去离子水稍微漂洗PVDF膜，再用滤纸贴脚吸去膜上残余液体，将膜平放，反贴法覆于A、B混合液滴上，避光反应3分钟，可适当延长；舍弃ECL混合液置于暗盒中曝光显影，曝光时间控制在30s左右。取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

WB灰度分析

关于WB结果的灰度分析，可以看下面这篇
关于Western blot的灰度分析？WB异常结果盘点与原因解析

12个高频异常结果
#1 无背景无条带


经验分享
上图展示一点信号都没有，大部分情况是因为抗体加错了。如果中间出现细微的条带，可能是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL 发光液失效。

#2 高背景


经验分享
高背景是 WB 实验中最常见的问题，目的条带单一清晰，但其他地方又弥漫性较均一的背景（比较连续的）。杂带多大概率是抗体特异性不好，也有可能抗体浓度太高，可尝试降低一抗浓度进行实验。

#3 非特异性条带


经验分享
此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然也有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。

#4 条带中出现边缘规则的白圈


经验分享
我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不宜太多或太少，建议高度与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住 NC 膜的两侧中间，使膜成 U 型，然后将 U 型底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，最后盖上海绵。

#5 出现黑点和黑斑


经验分享
牛奶溶解后，最好静止一下，然后轻轻吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束后一定要洗 3 遍之后再加一抗。

#6 条带拖尾


经验分享
这种情况一般出现在大分子量抗体实验中，是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议 5min*5 次，不要担心洗这么多次把抗体和蛋白洗掉了，真正的抗原抗体相结合通过这种方式是洗不掉的。

#7 出现非均一性背景


经验分享
封闭时洗一抗洗二抗，以及发光时都应时刻注意切记蛋白面风干，一旦风干很可能会导致这个结果。

#8 某个条带变形


经验分享
很多实验室中使用的不是最新设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris 缓冲液要注意不要有杂质。

#9 条带不均一


经验分享
出现哑铃最大的可能是胶没有配好，胶凝固后不均一。如果你拔完梳子后出现上图中下面部分的情况，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。

#10 最边缘条带弯曲


经验分享
一般我们使用的是 10 孔的胶，如果你上样刚好 10 个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一

#11 条带笑脸，marker正常


经验分享
准备样本主要确认上样缓冲液是否为近期配置，并且要妥善保存，否则就会浪费珍贵的实验样本。一般电泳过程中恒压电泳，浓缩胶 80V，分离胶 120V，整个过程差不多需 2 个小时左右。

#12 曝光结果条带扭曲


经验分享
对于大分子量的抗体，跑胶前可以先把样本煮一下，然后稍微离心一下，同样也可以改善这种情况。

7个灵魂提问

#1 为啥条带形状不好看？
可能的原因有：
a.胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀
b.某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致
c.缓冲液陈旧，成分改变,可以重配
d.凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走
e.电泳时温度过高，可以降低电流或电压
f.样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀
#2 蛋白条带位置（大小）不对咋整？
可能的原因有：
a.胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度
b.抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间
c.酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
d.目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定
e.标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量
#3 暗背景上白色带是咋回事？
可能的原因有：
a.抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂
b.HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓度
c.HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体
d.抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床
#4 细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
可能的原因有：
a.细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；
b.抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；
c.可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长；
d.细胞中的蛋白质被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性。
#5 目的带很弱，如何加强？
a.可以加大抗原上样量，这是最主要的；
b..也可以将一抗稀释比例降低；
c.还可以延长曝光时间。
#6 我做的蛋白质分子量很小(10KD)，怎么做WB?
a.可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；
b.也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。
#7 有很多杂带咋回事？
可能的原因有：
a.目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小
b.样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作
c.杂蛋白多，建议处理目的蛋白
d.抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体
e.抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间
f.二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物
g.二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度
h.底物显色与曝光时间过长，建议缩短显色及曝光的时间

电泳和转印环节的 11 条 Tips

Tip 1：洗净上样孔
在加样之前，用移液枪吹洗每个上样孔，洗净残留在上样孔中的丙烯酰胺残渣，从而避免畸形条带的出现。
Tip 2：凝胶过热是大忌
如果凝胶在电泳过程中温度过高，则条带可能会出现「微笑」形状，即条带两侧向上弯曲的现象。切记要正确使用缓冲液，并控制好电泳功率，避免凝胶过热的出现。
Tip 3：确保样品缓冲液离子强度正确
样品中的盐离子强度过高（或过低），都会导致条带出现偏斜或扭曲。如果样品提取过程中用到高盐溶液，就有可能要在上样前进行稀释或脱盐处理。
Tip 4：不要过载上样
加大上样量有利于检测稀有目标蛋白。但过大的上样量会导致电泳过程中出现垂直条纹。如果必须大量上样时（> 30 ug 总蛋白），可将电泳电压降低 25％，有助于减少条纹。
Tip 5：转印三明治要去除气泡
均匀的蛋白质转印需要三明治的各组件之间完全接触，尤其是凝胶和膜完全接触。没有去除的气泡会导致膜上出现空白点，直接影响实验结果！建议使用凝胶滚轮将这些气泡通通赶走！（提示：梯度凝胶最好上下滚动，而不是左右滚动。左右滚动会导致梯度凝胶翘曲和起皱。）
Tip 6：转印前的预平衡
湿转和传统半干转时，将凝胶电泳缓冲液替换为转印缓冲液可获得更好的转印效果。电泳缓冲液的带入会增加电导率，从而导致转印过程中产生过多的热量。可在水中短暂冲洗凝胶，然后在转印缓冲液中平衡凝胶 15 分钟，平衡膜 5 分钟。请注意，对于某些快速转印系统，不建议使用凝胶预平衡，请遵循制造商的操作指南。
Tip 7：NC 膜转印时避免使用 SDS
转印缓冲液中的 SDS 会降低蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率，所以在使用 NC 膜时要避免缓冲液体系内有 SDS。转印前用水冲洗凝胶，以便减少 SDS 带入转印体系。
Tip 8：PVDF 膜可使用 SDS
SDS 可以促进蛋白质从凝胶中洗脱，如果某些蛋白质难以从凝胶中洗脱，则可以将 SDS 添加到转印缓冲液中，前提是必须使用 PVDF 膜。
Tip 9：避免膜变干
在转印之前和之后均需保证膜的湿润，从转印三明治中取出后，转印热量会使膜容易变干燥。应迅速将膜浸入预先准备好的缓冲液中，以免膜干燥。（尤其是在使用 PVDF 膜时要格外注意，因为 PVDF 膜是疏水的更容易变干）。如果干了，可将硝酸纤维素膜重新在缓冲液中浸湿，而 PVDF 膜则需要在醇中重新活化。
Tip 10：半干转印功率及时间设置
使用高电场转印可获得更高的转印效率，但是一定要注意系统的散热能力，避免凝胶过热。转印期间，「三明治」温度升高会导致电阻变化，进而引发转印效率不均一，缓冲液失去缓冲能力，甚至凝胶融化。半干转印在电流下降接近为零时，延长转印时间不会增加转印效果。
Tip 11：使用两张膜判断蛋白是否会转穿
薄胶或低浓度胶转印过程中蛋白容易转穿，特别是针对小分子量蛋白。可以转印时叠放两张转印膜，然后对第二张膜进行总蛋白染色（丽春红或 Stain-Free 免染）的方法来判断是否已经转穿。

提高跑胶质量的7条Tips

Tip 1：蛋白分子量偏高或偏低
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说 100KD 的蛋白你用 12% 的胶跑，或者说 20KD 的蛋白你用 8% 的胶跑。
Tip2：蛋白质降解
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后出现一些其他带，最主要的特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
Tip3：所有条带连成一片无间隔
最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
Tip4：溴酚蓝拖尾
样品溶解不好或上样前未变性完全。
Tip5：纵向的纹理
上样样品中存在不溶性颗粒。
Tip5：溴酚蓝很粗
浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短或者配错。
Tip7：在分离胶中跑不动
Tris-Cl pH 值不对，或者忘记加 SDS。




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同花顺

Western Blot（蛋白质印迹）是一种重要的分子生物学技术，用于检测目标蛋白质的表达水平、分析蛋白质的大小和相对丰度以及确定其存在与否。这项技术在生命科学研究中广泛应用，包括生物医学研究、药物开发等领域。本文将详细介绍Western Blot的作用、原理及相关试剂，为读者揭开这一技术的神秘面纱。



蛋白免疫印迹

一、 Western Blot的作用：
Western Blot技术经过几十年的发展已经成为重要的蛋白质分析技术之一。它可以帮助科研人员在复杂混合体系中检测目标蛋白质的表达情况，从而了解其在不同组织或细胞中的存在、表达水平的差异以及在不同疾病状态下的变化。此外，Western Blot还可以帮助确定蛋白质的分子量、进行蛋白质定量以及研究蛋白质相互作用等。
二、 Western Blot的原理：
Western Blot技术基于蛋白质的电泳分离和免疫检测原理。一般分为以下几个步骤：样品制备、SDS-PAGE电泳分离、转膜、封闭、一抗结合、二抗结合和信号检测。
1. 样品制备：
样品制备是成功进行Western Blot的关键步骤之一。首先，需要提取目标蛋白质所在的组织或细胞，并用合适的缓冲液裂解细胞膜，释放蛋白质。然后，经过蛋白质定量和样品稀释，以确保相同的蛋白质量被加载到SDS-PAGE凝胶上。
2. SDS-PAGE电泳分离：
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是Western Blot中的核心步骤之一。它通过使用聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小来实现蛋白质的分子量分离。在SDS-PAGE过程中，样品中的蛋白质被加载到凝胶上，并在电场作用下，根据蛋白质的大小和电荷迁移至相应的位置。
3. 转膜：
转膜是将SDS-PAGE凝胶上分离的蛋白质转移到膜上的步骤。通常使用聚偏二氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。这一步骤的目的是将蛋白质迁移到膜上，以便后续的免疫检测。
4. 封闭：
转膜后，需要将膜中的非特异性结合位点进行封闭，以避免后续的免疫检测时的非特异性结合。常用的封闭剂包括牛血清蛋白（BSA）和非脂乳糜（NFDM）等。
5. 一抗结合：
一抗是具有对目标蛋白质的特异性识别能力的抗体。将一抗与目标蛋白质结合，可以生成一抗-蛋白质复合物。一抗的选择很关键，通常需要使用经过验证的特异性和高亲和力的抗体。



一抗

6. 二抗结合和信号检测：
二抗是针对一抗的抗体，它与一抗结合后，再结合到特定标记物上，例如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。标记物通过催化化学反应产生可定量检测的信号，例如发光、发色等。
三、western blot相关试剂：
1. 蛋白质提取缓冲液：用于提取目标蛋白质的组织或细胞，并裂解细胞膜，释放蛋白质。
2. SDS-PAGE凝胶：用于蛋白质的分离，根据蛋白质大小和电荷进行分子量分离。
3. 转膜膜：包括聚偏二氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜等，用于将蛋白质迁移到膜上。
4. 阻断剂：如牛血清蛋白（BSA）或非脂乳糜（NFDM），用于封闭膜上的非特异性结合位点。
5. 一抗：针对目标蛋白质的特异性抗体，用于与目标蛋白质结合，形成复合物。
6. 二抗：针对一抗的抗体，通常与标记物结合，用于标记复合物，产生可定量的信号。



抗体试剂

   Western Blot技术已成为生命科学研究中重要的蛋白质分析技术之一，通过其对目标蛋白质的检测、分析和定量，为科研人员提供了丰富的数据和信息。了解Western Blot的原理和相关试剂，可以帮助读者更好地理解其在科学研究中的应用，并提高实验的成功率和结果的可靠性。
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清风寡欲

7年前的提问，大一新生如今也该变成WB老油子，不用问这种问题了
鄙人曾经是WesternBullshit小能手，有一段时期总是跑不出理想的趋势，魔怔到天天在pyq发比企谷老师的「失敗に関して俺は最強」，现在看这问题还是有点犯ptsd
已经有高赞讲了很细致的原理步骤，我就拿课本和论文讲个自认为比较通俗的，直接说WB是为了什么
简单来说就是为了确认病理状态下某种功能蛋白的表达水平相比正常状态是否有差异，做WB能获得这个目标蛋白的表达水平证据，有差异的话可以进一步验证该目标蛋白是否参与病理状态的成因，考虑可否通过干预目标蛋白治疗疾病，云云
<hr/>看《肿瘤学》八年制课本，它告诉我们吉非替尼用于治疗EGFR(表皮生长因子受体)突变阳性的非小细胞肺癌


表皮生长因子受体是一类跨膜蛋白，能接受胞外生长信号(即表皮生长因子EGF)促进细胞增殖。许多肿瘤会出现EGFR的过度表达


EGFR结合EGF后激活其酪氨酸激酶活性，使酪氨酸残基磷酸化，正向调节细胞增殖。肿瘤细胞也利用这一信号通路增殖，针对这一信号通路可以用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，吉非替尼就属于TKI


如肿瘤学课本所说，吉非替尼适用于治疗有EGFR突变的非小细胞肺癌患者是在临床应用后才发现的，那确证其作用的微观机制证据呢？来自这篇20年前的NEJM文章，里面提供了吉非替尼能抑制突变EGFR的WesternBlot证据




上图中的A和C就是WB的结果图像，简单解释一下，条带越黑说明检测的目标蛋白表达水平越高，反之越低。
WildType是EGFR正常的细胞，下面两行是EGFR突变的细胞
左侧Anti-Y1068是指条带表示的是磷酸化EGFR的水平（磷酸化代表激活状态），右侧是EGFR总体表达水平。上面的时间是指给予细胞EGF刺激相应时间后再检测，如果同一时间点右边条带灰度相近，左边条带越黑说明EGFR激活程度越高
图A可以看到正常EGFR在EGF刺激15min后激活程度逐渐降低，而突变EGFR持续激活了3h
图C是用不同浓度的吉非替尼预处理细胞3h再给予EGF刺激30min后检测磷酸化EGFR水平，可以看到对WildType需要2微摩能完全抑制，对有EGF突变组则是0.015~0.2微摩间能完全抑制(原文表述，貌似跟WB图像没有那么符合？)
综上，从WB图像我们得知突变EGFR对上游EGF刺激更易感，激活程度高且持久导致细胞异常增殖，吉非替尼可显著抑制突变EGFR的激活
<hr/>本来就学得差，也没正儿八经搞过几年，估计讲得很不严谨，将就看看吧...
看到有老哥说WB是无法避免造假的落后实验，只能说"发明者诺奖得主本意是好的，都怪某些小朋友执行坏了"

卡卡

Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树，后人乘凉，现在我就把各位前辈做WB的各种经验总结起来，全文如下↓
同时，也为大家整理了一份实验 Protocol 资源包。标书、毕业论文都能用上！
包括不同研究水平实验技术Protocol，常见细胞动物实验技术总结，不同实验方法全流程，WB实验流程、注意事项、数据处理及写作，IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等，全都是经过前辈们无数次验证过的，绝对靠谱！
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正文开始。
WB实验的基本常识

WB的基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。


两种的方法的优缺点比较：


WB的一般流程：


蛋白的提取


需谨记：好的蛋白是WB成功的一半！
经验总结：
1.合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2.尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子3.提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。4.蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。5.蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。
电泳



凝胶浓度与蛋白分离范围


经验总结：
1.上样时：根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。2.胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。3.为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参（一般指由管家基因编码表达的蛋白）。


4.为了确保western blot结果的准确性和特异性，设置合适正确的对照是必不可少，一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。转膜（Western blot 成败的关键）
用于western blot的杂交膜主要有两种：NC膜和PVDF膜，可依据目的蛋白与膜的结合能力及膜的孔径来挑选不同的转移膜。
点击立即前往两个膜之间的比较：


转膜方法：分为两种湿转法和半干法




经验总结：
1.胶在负极，膜靠近正极；滤纸不要大过膜，防止短路；2.夹好膜和凝胶后，确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。3.注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。4.转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常 会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。5.对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
点击立即前往免疫印迹



经验总结：
1.常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液（生物试剂公司提供）。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。2.选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。


WB结果定量分析

WB做完后，有时需要对结果进行定量。然而最备受推崇的定量分析软件Quantiy One软件因其高昂的售价令很多人望而却步，但除了该软件外还有一个比较简单的图像处理软件ImageJ可以很方便的进行灰度和密度分析。ImageJ的软件界面


1.ImageJ对WB条带进行灰度分析
1）File|Open打开WB结果图片
2）图片类型设置：Image|Type|8bit


3）去除图片背景：Process|Subtract Background在Subtract Background窗口按照以下条件进行设置：


4）设置定量参数：Analyze |SetMeasurements,点击Area，Mean Gray Value及Integrated Density


5）设置单位: Analyze|SetScale,在“unit of length”的方框里输入“pixels”
6）将图片转换成亮带，Edit|Invert


7）选择Freehand Selection,尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值


8）复制数据IntDen进行分析
2. Image J 对WB条带进行密度分析
1）步骤同前，File|Open打开WB结果图片
2）如果条带不正，需修正


Image transform rotate调节angle值，直到条带水平为止
3）选中矩形选项，圈中第一个条带，AnalyzeGels Select Firstlane（快捷键Ctrl +1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，Analyze Gels Select Second Lane（快捷键Ctrl+2）,最后Analyze GelPlotlanes
4）选中直线工具，将开口的波峰关闭
5）选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值
6）以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值即为相对密度。
点击立即前往WB疑难杂症















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猫大硕士毕业后曾在技术公司担任实验室主管，又经博士阶段系统科学训练，实验技能极为丰富全面。
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免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。通俗来讲，将蛋白质通过电转固相到膜上，然后利用抗体检测蛋白表达的方法。与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western blot。
Western Blotting可用于：
1.从细胞或组织总蛋白中检测目标蛋白;
2.定量或定性确定目标蛋白表达水平;
3.蛋白-蛋白，DNA-蛋白，RNA-蛋白相互作用的检测分析。
实验原理：
蛋白研究样品通过恒定电流电泳经过PAGE胶，由于各蛋白所带分子量不同而产生不同的电泳速度而被分离。通过电转移固相到PVDF膜或NC膜，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
科研中的运用：

（1） 检测细胞中目的蛋白的表达
通过WB技术直接检测干细胞分化、细胞自噬、细胞凋亡、周期蛋白、DNA损伤修复、分子诊断标志物等关键通路蛋白，可评估细胞或机体所处的生物学状态。



图1.通过WB检测经典Yamanaka因子评估胚胎干细胞的分化[1]

（2） 对基因的功能缺失研究
通过敲减或过表达目的基因后，用WB技术检测相关通路蛋白的表达变化，以确定目的基因激活或抑制目的蛋白的表达调控关系，探究信号通路。



  图2. WB证明敲减EZH2上调p21蛋白表达[2]

（3） 研究目的蛋白所处的细胞定位
蛋白的分选投递与发挥功能是基因调控的结果，因此改变了某些基因的活性，或化学修饰可能会影响其效应蛋白的转运，改变细胞核质中的分布，引发不同的生物学效应。



图3.通过WB检测目的蛋白LIN28A在细胞核质中的分布[3]

（4） 药物处理、代谢类的研究





图4.研究药物处理时间或计量的不同对效应蛋白的研究[4]

（5） 蛋白相互作用类研究
通过WB可检测Co-IP、RIP、CHIRP等实验的IP产物，研究目标蛋白-蛋白，RNA-蛋白之间的相互作用。



图5. 不同的Trp53等位基因不成程度的与效应蛋白MDM2相互作用[5]

实验流程：



一、 试剂准备
1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验;
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml;
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml;
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml;
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中;
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μL。
二、 蛋白样品制备
贴壁细胞样品
1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液;
2. 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上;
3. 按1ml裂解液加10 μL PMSF（100 mM），摇匀置于冰上;
4. 每瓶细胞加400 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动;
5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中;
6. 于4℃下12000 rpm离心5 min;
7. 将离心后的上清分装转移到0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
组织总蛋白的提取
1. 将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎;
2. 加400 uL单去污剂裂解液裂（含PMSF或蛋白酶抑制剂）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上;
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎;
4. 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
三、 蛋白定量
根据蛋白定量试剂盒（通常使用BCA法），对样品中总蛋白浓度进行定量。
四、 SDS－PAGE电泳
1. 将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析;
2. 电泳:在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压80V,分离胶电压150V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需2hr）。
五、 转膜
1. 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次 ;
2. 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的6张滤纸和PVDF膜，将膜在甲醇中浸泡15秒，然后再在蒸馏水中浸泡2min，最后在转膜缓冲液中最少平衡5min;
3. 转膜：转膜装置从下至上依次按阴极碳板、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、阳极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡。接通电源,恒流250mA，转移120min (具体转膜时间可根据目的蛋白分子量大小与转膜电流调整)。
六、 免疫反应：
1. 用0.01M PBST洗膜(pH7.4, 0.02%吐 温20)，5min ×3次;
2. 封闭：将纤维素膜置于一塑料袋中，加封闭液(5%脱脂牛奶)，室温下孵育1小时或4℃过夜;
3. 加入以1mg/ml浓度，1:1000稀释的一抗抗体，室温孵育2h或4℃过夜;
4. 用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min;
5. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。
七、 化学发光，显影，定影
1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中;
2. 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上固定，关上X-光片夹，根据信号的强弱适当调整曝光时间；曝光完成后，将X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2 min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
八、 凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用image J等凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和灰度值。
问题解决
1. 检测到蛋白条带背景较深？
(1) 可适当增加TBST中的吐温浓度;
(2) 缩短二抗孵育时间;
(3) 增加牛奶封闭时间;
(4) 增加洗膜次数与时间;
(5) 降低抗体浓度;
(6) 转膜时注意用冰盒降温;
(7)更换抗体，选用特异性更好的WB抗体。
2. 检测到条带倾斜？
(1) 配PAGE胶时充分混匀;
(2)上胶时充分等到胶体凝固再电泳;
(3) 检查电泳盒中导电线是否水平;
(4) 降低上样总体积体系。
3. 目的蛋白分离不充分？
根据检测蛋白分子量，增加分离胶浓度与电泳时间。
4. 未检测到蛋白条带？
(1) 蛋白样品制备后需要注意低温保存，防止蛋白降解;
(2) 确定上样浓度，调整上样体积;
(3) 转膜时确定电极是否正确;
(4) 转膜液重复利用次数太多，甲醇挥发较多;
(5) 确定AB荧光液充分混匀;
(6) 显色液应保证时间较新,显影时增加曝光时间。
参考文献：
1.WA, W., S, B., DA, O., HA, H., GM, F., CT, F., SM, C., and RA, Y. (2018). Author Correction: Enhancer decommissioning by LSD1 during embryonic stem cell differentiation. Nature 562, E24.
2.Y, S., SD, J., Q, Z., L, H., J, F., XY, L., W, W., F, W., and RH, G. (2017). Long non-coding RNA LUCAT1 is associated with poor prognosis in human non-small lung cancer and regulates cell proliferation via epigenetically repressing p21 and p57 expression. Oncotarget 8, 28297-28311.
3.SK, K., H, L., K, H., SC, K., Y, C., SW, P., G, B., Y, L., JK, C., TK, K., et al. (2014). SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs. Cell stem cell 15, 735-749.
4.B, W., D, L., A, K., D, L., and O, K. (2014). Ionizing radiation-inducible miR-27b suppresses leukemia proliferation via targeting cyclin A2. International journal of radiation oncology, biology, physics 90, 53-62.
5.SS, M., LJ, V., N, R., JA, S., BM, F., J, M., KT, B.-R., J, L., D, I., MM, K., et al. (2017). A p53 Super-tumor Suppressor Reveals a Tumor Suppressive p53-Ptpn14-Yap Axis in Pancreatic Cancer. Cancer cell 32, 460-473.e466.