【Western-Blotting】干货！探讨几个小问题及经验分享

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前面几个帖子，笔者分享了WB的技术及技术的理论基础和特定步骤中的技巧、个人经验。此贴，笔者探讨几个小问题及经验分享：
1、转膜及抗体孵育时，整张膜还是裁膜？
转膜时，有的研究者和课题组为了省PVDF膜/NC膜，会选择裁胶和裁膜，然后转膜，节省原料，随后分别孵育抗体；大部分实验室。如无经费方面的考量，笔者推荐整张分离胶转膜，这样一次WB就可以得到尽可能多的蛋白，加上抗体洗脱液（stripping buffer），不裁膜的情况下，一次WB能检测最少3-5个目的蛋白（同一张膜笔者常重复系统3-5次）。从费用及效率的角度讲，抗体洗脱省时、省钱。
抗体孵育时，国内大部分研究者和课题组还是会选择裁膜，根据目的蛋白分子量裁呈2-4段，分别孵育抗体。裁膜孵育抗体的确省时省力、保证实验效率，但有的杂志，尤其时高分杂志，往往会要求论文作者要求提供整张膜的原始图片，对于有考分杂志考量的朋友建议整张膜孵育抗体。
2、抗体洗脱，应该注意什么？
绝大多数情况下，杂志社还是接受抗体洗脱以后得到的实验结果的。很多研究者和实验室不愿使用stripping buffer一般有两方面的原因：stripping后得到的结果容易有多条带（洗脱不彻底）和商业化的stripping buffer价格较贵。对于多条带的问题，大部分研究者的经验是：先孵育条带较弱（表达较低）的蛋白，再孵育条带明显（表达较高）的蛋白，最后再孵育内参；分子量相近的不同蛋白（如磷酸化蛋白和总蛋白）、一抗种属来源一致（使用相同的二抗）的情况下，不建议抗体洗脱后再孵育；如一抗种属来源不一致，即使分子量接近的蛋白，只要洗脱够彻底，也不会产生多条带。从价格角度讲，stripping还是相对划算，毕竟能省去重复实验，也能节省实验样本；此外，笔者经验，商业化的stripping buffer也可重复使用，笔者经验是回收stripping buffer、4℃保存，可反复使用4-5次，重复使用次数越多，洗脱时间稍延长。
3、WB条带有背景，或者背景很重？
一般情况下，如果牛奶/BSA封闭较好，不太可能产生实验背景。但少数情况，仍有可能产生背景：
a、牛奶或封闭用BSA产生的非特异性结合，引起背景。这在使用种属来源于山羊（goat）的一抗时常有发生，因为山羊来源的蛋白与牛来源的蛋白具有较高的同源性，抗山羊二抗容易与牛奶/BSA特异性结合产生背景；此种情况下，一般推荐用驴血清封闭；笔者经验是如无驴血清，仍可用牛奶封闭，只不过笔者会提前一天用牛奶配制二抗，提前让二抗与牛奶进行非特异结合，并回收二抗、重复使用，笔者的这种方法做出来的条带背景与朋友使用驴血清的背景相当。
b、抗体回收、重复利用：抗体纯化后，或多或少遗留动物来源的非特异性免疫球蛋白，这些免疫球蛋白可能与膜或者封闭液产生非特异性结合，产生背景，在初次使用时背景偏重，随着抗体回收、重复利用的次数越多，背景会越来越淡，在此特别推荐抗体回收（因笔者见老板和隔壁实验室的同学从不回收抗体，他们担心回收抗体影响结果）；在初次使用时，亦可通过延长PBST漂洗时间来降低背景，笔者曾过夜漂洗过NC膜，背景显著降低，同时并不影响WB的特异性条带。
c、抗体孵育时一抗体积小，有的研究者和课题组为了节省抗体，孵育一抗时，仅使用200-500微升抗体、静置贴敷、孵育，使得一抗中的杂质非特异性结合，导致产生背景；笔者建议使用大体积（3-5ml）、在摇床孵育一抗，一来能减轻背景，二来也并不会因为大体积（一般3-5微升一抗）而浪费抗体（这3-5ul抗体一般够做一个课题的所有WB的实验）。
4、目的条带太淡？
首先考虑上样量（10-20ug）和抗体效价及质量够不够，还有操作（电泳、转膜等），如能排除上述问题，可能是由于目的蛋白表达偏低引起的条带偏淡，可通过增加上样量来提升条带亮度，而一般来说提高一抗浓度并不能提高条带亮度，反而可能导致背景；另外，笔者经验是可以重复依次孵育一抗二抗（无需抗体洗脱），再重复曝光，增加条带亮度；如用胶片曝光，可延长压片时间（数小时，甚至过夜）来提升条带亮度（国内实验室常用的仪器曝光不能实现这个目的）。
5、WB结果分析，分析条带灰度、算比值？
这一方法在国内研究者使用较多，不仅能增加图的“数量”，还能增加差异的“显著性”（较肉眼）。但国外研究者很少使用这一方法，主要是国外研究者认为肉眼不可见的差异或者肉眼可见的“轻微”差异，很难能说明实际的差异，一般不太用来作为阳性结果。因此，笔者也并不推荐算灰度值和目的蛋白/内参的比值这一做法来分析WB结果。
上述内容仅是笔者个人经验，欢迎探讨和留言交流更多的WB相关经验。

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