分子诊断是否会取代免疫诊断？

wolf

来源：知乎
一些诊断项目，如传染病，既能用免疫诊断相关抗体，又可以用分子诊断直接检测血清中的DNA、RNA等，而分子诊断因为可以进行核酸的扩增，灵敏度更高。这是不是意味着，分子诊断将会很快取代免疫诊断，未来只需要分子诊断结果作为金标准呢？

原文地址：https://www.zhihu.com/question/360845367

病理医师

基于CRISPR/Cas系统的诊断技术自问世以来，其对无仪器核酸检测技术的需求推动了多种等温扩增技术和快速检测工具的发展。尤其以Cas12和Cas13为代表的单Cas酶反应体系更是获得快速发展，除在基因编辑领域已有诸多应用外，在诊断领域的发展同样迅速。本篇文章主要针对基于CRISPR/Cas技术的不同系统在诊断领域的应用进行简单介绍。
CRISPR/Cas9诊断系统：在基因编辑和诊断领域，Cas9是最早被应用和开发的。2016年，James Collins博士领导的国际小组通过把Cas9和PCR进行结合开发了一种针对寨卡病毒分型的特异性检测方法（图1）[1]。但由于存在着Cas9只能靶向DNA、蛋白体积过大、脱靶效应等方面的不足，同时检测时间长且需要变温反应，该系统在诊断产品开发方向并未得到广泛应用。



图1 基于Cas9开发的寨卡病毒检测系统

与Cas9不同，Cas12或Cas13除了能够在识别目标序列后启动靶向切割活性，还具有非特异性性切割体系内DNA或RNA的能力（即“反式切割活性”）。利用该反式切割活性，使带有荧光基团的报告分子释放荧光，构成了以Cas12或Cas13反式切割活性为基础的CRISPR/Cas诊断技术：其中以SHERLOCK诊断系统、DETECTR诊断系统、HOLMES诊断系统以及CDetection诊断系统为代表。

SHERLOCK诊断系统：2017年，张峰及其同事提出了一种结合靶基因预扩增技术（RPA或RT-RPA）与Cas13a酶活的诊断平台——SHERLOCK诊断系统（图2）[2]。该系统表现出的单分子检测灵敏度及单碱基的特异性是CRISPR诊断领域中具有里程碑意义的重要工作，然而其只能定性而不能定量检测，同时在扩增与检测之间需要开盖转移易造成气溶胶污染。因此第二代SHERLOCK v2技术增加Csm蛋白和多种Cas蛋白，并将纸基传感器引入系统，使结果可视且更快捷。此外，整个SHERLOCK v2反应一步进行，采用Cas13酶一步法（边扩增边检测）完成整个检测过程。研究证明，SHERLOCK可以检测Zika病毒、登革热病毒、各种致病菌和DNA中的单核苷酸多态性（SNPs）。以该技术为基础开发的新冠检测产品在2020年5月获得了新冠检测的EUA，成为全球第一个注册获批的CRISPR诊断试剂。



图2 CRISPR-Cas诊断平台的原理图—SHERLOCK/v2


DETECTR诊断系统：Cas12a（Cpf1）是一种CRISPR-Cas突变体，与Cas9类似，它也能切割双链DNA，而Doudna实验室发现了Cas12a切割非特异性（反式）单链DNA的能力，并利用这一能力创建了一个称为DETECTR的DNA检测平台[3]。当靶标核酸存在时，通过恒温扩增（RPA）特定产物，并通过Cas12a和sgRNA复合物进行特异性识别，同时激活Cas12a反式切割活性，将FQ-ssDNA报告探针切割并发出荧光。





图3 CRISPR-Cas DETECTR和OR-DETECTR诊断平台的原理图


DETECTR系统从流程上更有优势，不仅步骤上更少，而且所用到的探针为ssDNA探针，合成便宜且保存稳定。为了解决两步法的气溶胶污染以及提高检测灵敏度和特异性，同样将恒温扩增与基于Cas12a的CRISPR检测整合在一个系统中，将检测时长从2个小时缩短至30分钟内。

HOLMES诊断系统：同样是利用Cas12a的反式切割活性，国内王金教授团队通过PCR步骤实现模板扩增开发了HOLMES系统（图4）[4-5]。随后，该团队又基于LAMP-Cas12b开发了HOLMES v2系统，并开发了One-Pot一步法CRISPR诊断体系，同时，HOLMES v2可与digital PCR体系联用实现对靶标核酸的绝对定量。测试数据显示，Cas12b的反式切割活性对ssDNA的亲和力要好于dsDNA，具有更宽的反应温度范围，而且灵敏度与Cas12a相当，同时该团队系统优化了Cas12a的反应系统，定义了其反式裂解单位（transU）[6]。在专利方面，王金教授与张峰教授达成了中美市场的专利“交叉授权”合作，共同推进CRISPR诊断产业的快速发展。



图4 HOLMES/v2诊断系统

CDetection诊断系统：由中国科学院周淇院士团队开发的具有独立知识产权的CDetection诊断系统，采用具有较宽反应温度范围（25-60℃）和pH稳定性（1-8）的AaCas12b，通过AaCas12b-sgRNA复合物特异性识别靶标基因后，激活其反式切割活性，高效的切割体系内ssDNA荧光报告分子，从而发出荧光信号，该系统能够适应不同环境下的检测条件。使用RT-RAA和Cas12b优化系统成分和反应条件，该团队开发了一种Cas12b辅助的one-pot检测平台（CDetection v2），能够在30分钟内快速检测SARS-CoV-2，而不与其他病毒交叉反应[7-8]。




图5 CDetection v2结果的可视化

基于CRISPR的分子诊断技术简单、快速，搭载恒温扩增则无需复杂仪器，不同特性Cas蛋白的发现，丰富了检测核酸类型的选择，从dsDNA到ssDNA再到RNA，均可作为CRISPR/Cas分子诊断系统的靶序列，结合各种可视化反应，为分子即时诊断的应用带来更多发展可能（表1）。




表1 基于CRISPR/Cas系统的诊断技术

珠海舒桐医疗科技有限公司长期致力于基因编辑领域，研发团队潜心研发，具备完善的CRISPR/Cas分子克隆平台以及相关蛋白纯化技术，有着丰富的体外诊断经验以及研发管线。今年2月，舒桐自研高保真CRISPR-FrCas9获国际专利授权，本项专利CRISPR-FrCas9是目前已知的切割效率最强、脱靶效应最低、特异性最好、PAM限制最少的CRISPR，显著优于SpCas9。此外，珠海舒桐医疗是国内首家提供脱靶检测服务的公司，可提供GUIDE-seq体内脱靶检测、AID-seq体内脱靶检测等多种服务，欢迎垂询。

关于舒桐
珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，产品质量达到领先水平，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。
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参考文献：
[1] Pardee K, Green AA, Takahashi MK, et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 2016 May 19;165(5):1255-1266.
[2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017 Apr 28;356(6336):438-442.
[3] Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27;360(6387):436-439.
[4] Li SY, Cheng QX, Wang JM, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov. 2018 Apr 24;4:20.
[5] Li L, Li S, Wu N, et al. HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation. ACS Synth Biol. 2019 Oct 18;8(10):2228-2237.
[6] Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a Trans-Cleavage Units to Facilitate CRISPR Diagnostics. Front Microbiol. 2021 Nov 29;12:766464.
[7] Teng F, Guo L, Cui T, et al. CDetection: CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity. Genome Biol. 2019 Jul 1;20(1):132.
[8] Wang X, Chen Y, Cheng X, et al. CDetection.v2: One-pot assay for the detection of SARS-CoV-2. Front Microbiol. 2023 Mar 23;14:1158163.

检验之星

这是一个很好的问题！血清学测试（免疫诊断），例如 ELISA，依赖于病毒和其他病原体被免疫系统识别为“外来”并刺激特定抗体的产生这一事实。抗体不仅帮助免疫系统应对第一次感染，而且它们仍保持在低水平，作为识别同一病原体未来尝试的哨兵。血清学检测不仅可以识别急性感染并跟踪其进展，还可以显示个人过去是否曾接触过感染。

尽管血清学是一种有用的诊断工具，但它确实有许多缺点。身体对感染产生免疫反应需要时间，因此血清学在感染的早期阶段可能用途有限。在某些感染中，免疫反应比其他感染更快、持续时间更长；在某些情况下，可能反应很小。在测试和解释结果时，这种知识是必不可少的。

例如，疫苗接种通过刺激产生针对特定病原体的抗体来发挥作用，从而提高对感染的保护水平。在许多情况下，血清学检测可以区分接种疫苗的患者和暴露于自然感染的患者，例如乙型肝炎患者。

另一方面，基于分子 PCR 的诊断测试可检测病原体本身或其核酸的存在，因此可以在抗体产生之前的早期阶段检测感染。只要没有病毒颗粒，任何疾病的疫苗接种患者都会通过 PCR 检测呈阴性。然而，那些过去接触过感染但不再出现病毒血症的人也会如此。一些感染只产生短时间的病毒血症，因此必须在正确的感染阶段应用基于 PCR 的测试才能发挥作用。

很明显，血清学测试和基于分子技术的测试都可以发挥作用。 ELISA - 最实用的血清学工具 - 是长期管理患者的绝佳方法；实时 PCR 可以成为分析急性期疾病的正确工具，因为它具有更高的灵敏度。关键是了解每种方法的优缺点，从而了解适用于每种情况的最合适的技术。在某些情况下，两者的结合可能提供最准确和最具成本效益的保护和改善健康的方法。

考虑到不断开发和验证新的测试和技术，遇到问题的话还是要向您的医生寻求建议。

虎威将军

两回事，可以互补，没有替代这种可能。免疫的大部分诊断也依靠分子水平的检测。

卡卡

恐怕不能。应该说，疾病的复杂性决定了，几乎没有任何一个单独的实验室检测方法可以适用于一类疾病的决定性诊断。

为了更有针对性，下面的讨论都是基于感染性疾病，常见的包括细菌、真菌、病毒及支原体、衣原体、放线菌和少量原虫，不纳入多细胞的寄生虫病。

分子诊断的好处是灵敏度和检查耐药基因。即使是很少的标本，通过核酸扩增也能得到可堪分析的片段，这一般优于使用单克隆抗体诊断的免疫学检测。对于一些“检出即优先考虑为病原菌”的情况，比如使用咽拭子查百日咳鲍特菌，或者在痰和肺泡灌洗液标本查结核菌，比传统的细菌培养快很多，并且能检查一些结核耐药基因。类似地，对于难以培养的肺炎支原体，可以检测其有无，也可以检测其常见的耐药位点。在一些很难查到抗体的环境里（比如脑脊液），分子诊断更能发挥出高灵敏度的优势。另外，分子诊断一般2-3天出结果，基本还是满足临床的需求的，比结核培养数周要好多了（当然还是不能代替）。而如果使用传统的、最正统的血清学试验进行确诊，第一周抽个血，过四周再抽个血看滴度，病人也不用你看了。PCR出阳性的时候，可能体内的IgM抗体还没制造出来呢……从速度上讲，PCR和单次检测的化学发光的免疫学方法比慢一点（所以对肝炎是做载量，以求比乙肝五项提供更准确的病毒复制信息），比传统的血清学试验快得多，比POCT的胶体金慢（但是更灵敏和准确）。

然而，分子手段在很多时候有巨大的局限性。

先说一句，免疫学的方法缺陷也很多，在很多时候免疫学检测并非感染性疾病病因检查的必选方法（特别是对细菌感染）。

首先是个检测费用的问题，现在大宗检测使用的抗体，比如乙肝五项，是可以做的很便宜，又有很好的准确性，覆盖几个最主要的乙肝抗原（抗体）上面的可供检测抗体结合的抗原决定簇——相比之下，现行的PCR试剂盒普遍更贵。至少对于大宗的病原体检测，PCR试剂更难保存也更贵，就很难具备推广的能力。

其次，分子方法也具有自己的问题，比如假阳性。免疫学方法和分子方法都有假阳性，但免疫学方法通常不会被认为是病原诊断的金标准，所以压力是比较小的。同样地，分子也是个好的方法，但对于金标准而言，它的特异性不总是十分理想的。一般来说，在我们实际的临床检测中，PCR因为采样不佳导致假阴性的可能性会比免疫学方法大一些，因为免疫学的检出限更高一些，受干扰的容忍度稍高；用血液做标本的话，比PCR的拭子的样本质量更容易控制。

第三，分子检测涉及到结果判读的问题，比免疫学更复杂。这里不是说“看不懂报告”的情况，而是，对于免疫学报告，如果我们检出IgM或者效应淋巴细胞阳性，至少在一个确定的周期内（数天到数个月不等），你知道这个病原体确实造成了感染；对于复杂体液标本（譬如腹腔积液），在检出多个菌的时候，你能有把握哪种是最主要的吗？对于肺部感染、反复发热，既有细菌又有病毒还有支原体，做mNGS能确定哪个是最主要的病因吗？最终还是回到结合临床表现的道路上去。有答主提到分子诊断“挖到根上”，但这同样要涉及到实际情况——如果只是看灵敏度，把核酸和IgM看成一样的诊断标准，那分子检测是更好的；如果要看对机体的作用，那Tspot-TB对于结核感染的阳性结果比Xpert-MTB更有说服力和更常用，Xpert的优势是可以检查耐药基因，但在结核的有无上未感到比Tspot优越。

以上的内容是2020年4月疫情刚出来的时候写的。过了一年多再看这个答案当然会感到诸多不满意之处，但只想写点添油的内容。就着刚才的内容再往下写写。

曾有一个这样的患者：她出生后三个月因肺炎入院新生儿科，未注射卡介苗，发育基本正常。经验性给抗生素覆盖阳性菌和阴性菌数天无效，因此扩大了对病原的调查范围。其中，针对结核的一组检查显示，痰涂片找抗酸杆菌阴性，结核菌素试验观察三日均阴性，TB-IGRA阳性（两个靶抗原均阳性，且不是靠近灰区），结核杆菌培养、X-pert.MTB因未开展而未做。因患儿从医院接回家后很少外出，继续筛查家属胸片，结果均阴性。患儿胸片显示肺门淋巴结肿大。

至此，我们考虑患者结核不能排除，因TB-IGRA阳性，且肺门淋巴结大符合初发肺结核“肺原发病灶、肺门淋巴结炎”的特点。但临床方面有反对意见，认为家属胸片阴性，无明确的感染来源，且结核菌素和痰涂片阴性，而TB-IGRA不能排除潜伏结核。至此，我们考虑的是，在未注射卡介苗的前提下，患者即使接触结核菌，也不满足迟发超敏反应的效应条件，且婴幼儿淋巴细胞发育不完善，所以结核菌素阴性；痰涂片敏感性差，且婴幼儿留痰常有质量不高的问题；家属胸片阴性，不一定不带菌。最后，延请呼吸科会诊，并请公卫的结核病专家会诊，临床最终还是确诊了结核，并且在几天后得到了小孩母亲的信息——曾有2次流产史（怀疑子宫结核导致的慢性炎症环境）、母亲追查T-SPOT.MTB阳性。

到此似乎没有提及分子生物学。但我在此的感受是，任何一个方法都会面临各种细节的挑战，即使是XPERT MTB，单次检查用于涂阴患者也有约30%的漏检。如何综合各个层次的证据给出结论，并考虑其中的理由，可能就是两个不同的方法学同时存在的意义。

长长的路

病的诊断方法，最好能达到以下效果：准确，快速，经济。我们分析一下。准确就是特异性，这是免疫学诊断一直以来的强项，但是分子诊断直接从基因方面来，挖到根上了，准确性较免疫学诊断应该只高不低；时间对于治疗和控制传染病有着极其重要的意义，人均百万的知乎我就不解释了，免疫学诊断的凝集实验（献血时测血型是应用之一）几分钟就能看到结果，最常用的ELISA一般一个小时左右出结果，虽然我不知道分子诊断需要多长时间，但我知道southern印迹杂交的步骤之多百度百科一页放不下；经济就是成本，高大上的方法又快又准但很贵，恐怕也无法广泛推广。能不能替代不重要，重要的是能为人类健康保驾护航。