实验室小白入门级实验protocol, PCR完整实验流程

临床医师

来源：知乎
PCR实验学习笔记
一、 基本概念
1. 总述：DNA克隆-利用重组DNA技术
DNA克隆：将目的基因/DNA片段与基因运载体重组，在宿主细胞中扩增得到大量相同DNA片段的过程。
基本过程：
① 重组DNA分子的构建：目的基因+载体——质粒构建
② 转化：将重组DNA分子转移到宿主细胞——细菌转化
③ 细胞克隆的选择增殖---细胞克隆
④ 分离重组DNA分子
★Fuctions：大量相同拷贝DNA，DNA文库(基因功能研究—生产蛋白质)和cDNA
二、 DNA克隆——利用PCR技术
Concept：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，体外程序化地特异性扩增某一DNA片段的技术。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加
三、 Steps
a) 变性：模板 DNA 经加热至 94℃ 左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
b) 退火 （复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；（退火温度与什么因素有关？）
c) 延伸：DNA 模板--引物结合物在 Taq 酶（耐高温）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的半保留复制链，这种新链又可成为下次循环的模板。一般为30个循环。
四、 实验步骤
1. 取灭菌的Ep管， 建立10μL反应体系（扩大12倍），离心混匀

Taq酶	5uL   （60 uL）12倍
Primer1	0.4 uL   （6.4uL）
Primer2	0.4 uL   （6.4uL）
H2O	3.4 uL    (40.8 uL）
DNA   template	细菌克隆

一般挑细菌阳性克隆DEPC水加3.4uL; 如果是DNA模板一般加1uL,此时DEPC加2.4ul
1. 设置PCR仪参数，最佳退火温度由引物Tm决定，熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。循环所用的延伸时间则根据目的基因长度及DNA聚合酶性能确定
★反应程序


2. 扩增产物用琼脂糖胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。

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