PCR实验经验交流（1）

检验之星

/

PCR实验经验交流（1）

/

1.PCR实验耗材需要高压灭菌吗？

不进行细菌或细胞培养的实验耗材，所用的Tip头和离心管无需进行高压灭菌处理！因为这些耗材都是从塑料颗粒热压塑形出来的，并不存在实验污染的病原核酸，由于高压并不能使DNA酶和RNA酶完全失去活性，反而高压会使Tip头和离心管发生变形，导至使用时封闭不严，严重影响实验效率和实验质量，而且高压灭菌过程也可能是污染传播的过程。

2.血清（血浆）样本中HBV、HCV和HIV的稳定性有何差别？

血清HBV的稳定性最好，一般100IU/mL的血清样本于-20℃保持5年，稳定性良好；血清HCV稳定性最差，1000IU/mL的血清样本，放置在室温（18～25℃）3天即降解到15IU/mL以下，但不同用药患者降解速度似乎不同，如使用索菲布韦治疗的HCV患者离体血清，降解似乎速度更快！这种治疗后的HCV阳性血清稳定性资料尚未查及，是很有价值的研究素材。血清中HIV的降解速度要比HCV慢的多，我们曾对1000IU/mL的HIV阳性血清样本进行稳定性研究，室温放置1周尚能持续检测为阳性，这和大家的习惯性观念大有不同。因此，无论临床检验还是实验室制备室内质控品，都应考虑样本稳定性的差异，特别是药物的干扰和影响。

3.高压灭菌、紫外照射、酒精喷洒和有效氯处理哪种清除污染最有效？

    我们对纯化的基因组核酸和扩增产物制备成一定的浓度，分别采用高压灭菌、紫外照射、酒精喷洒和有效氯浸泡的方式进行处理，然后对处理样本进行核酸纯化和PCR扩增。多次验证结果表明，高压灭菌和酒精喷洒对核酸污染的清除没有任何作用，反而会使污染扩散。紫外照射对扩增产物造成的污染有一定的效果，但及其有限。但采用0.2%～0.5%的有效氯消毒液浸泡，对核酸污染的清除效果非常显著，实验表明，按以上终浓度的有效氯消毒液处理半小时，可以使104IU/ml的基因组核酸下降到20IU/ml以下。
4.PCR实验室不分区就一定会发生实验室污染吗？

PCR分区的目的是避免交叉污染，不同房间的分割强迫不同物品专用，在某种程度上避免了直接接触污染的风险。国内不同医院的PCR实验室条件各有不同，但实验室发生污染的概率似乎与实验室是否分区没有关系，有的实验室严格安三室或四室要求进行建设，甚至设置净化设施，污染不但没有完全避免，而且清除很困难；有的实验室虽然在PCR实验室验收时勉强过关，但临床PCR基本都在一个房间进行，实际情况却是一个房间的PCR污染的发生率并不比标准实验室高；结合罗氏COBAS“一体机”的情况其实并不难理解，实验室硬件建设固然重要，但关键的因素还是“人的专业素养和水准”，如果操作的“人”能清晰污染来源的“关键点”，在什么样的场所做PCR实验似乎并不重要！当然，在没有官方许可和形成专业的防污染意识前，还是应按照强制性分区进行工作比较稳妥！

randomqd

关于污染，手套要勤换，至少不能从II区带到I区，
另外门把手,电泳房和质粒房出入一定要注意。
次氯酸除核酸这一点很重要，清洁时要用来擦移液器，台面等。。

黄先生

提供免费试用：可冻干预混液、新型热启动Taq酶、MMLV逆转录酶、Tth酶、直扩试剂、恒温扩增、纯模板快速扩增试剂，磁珠法核酸提取试剂盒。小黄 13189351059