PCT抗体偶联技术讨论

小金黎

2018.3.1

温度：2.16℃

湿度：60%

材料：

JSR胶乳微球，粒径240nm，用量（10mg）

PCT抗体，用量0.8mg

微球：抗体=10:0.8

活化液：50mM浓度MES，PH6.0

包被液：50mM浓度PBS，PH7.0

储存液：100mM浓度PBS，PH7.4，0.5%BSA，5%甘油，0.1%NaN3，8.76g/L氯化钠。

步骤：

一、偶联剂配制：0.2mgEDC、0.2mgNHS分别溶解于0.5ml MES中，现配现用。

二、活化：用MES稀释微球至0.5ml，微球w/v为2%，加入0.5mlEDC，再加入0.5mlNHS，室温搅拌反应30min，13000rmp/min离心5min，沉淀用1.5mlPBS重悬，50%  功率超声1min。

三、包被：用PBS稀释抗体至1.5ml，把抗体快速加入到活化后的微球中，室温搅拌反应3小时，加入2mg/ml BSA 1ml封闭反应1小时。

四、储存：13000rmp/min离心30分钟，沉淀用包被夜清洗两次，用5ml储存液重悬，50%功率超声5min，3000rmp/min离心15min，去除沉淀，2-8度保存。 4%PEG6000为R1，参数5:200:50，测试100ng/ml的PCT反应度才0.1左右，哪位高手帮分析一下，问题在哪里？？？

macro20

我准备做但还没开始，想问问楼主胶乳微球是什么材料（聚苯乙烯粒子吗？）；另外看了些资料，貌似尽量都用MES缓冲液，楼主中间包被的时候为什么要换成PBS呢？不知最后抗体和胶乳微球偶联效果如何，如果偶联效率低信号弱就很正常。具体怎么优化我没有方案，不过有个思路建议：楼主可以做几种不同的标记方案，最好区别大一点，最后再来看实验结果，这样去快速找到主要的影响因素然后做针对性的优化。

小金黎

使用的微球就是聚苯乙烯羧基微球，其实MES盒PBS效果都差不多，主要在于活化和包被缓冲液的浓度和PH。

macro20

小金黎 发表于 2018-3-16
使用的微球就是聚苯乙烯羧基微球，其实MES盒PBS效果都差不多，主要在于活化和包被缓冲液的浓度和PH。

超声的时间是不是太长了点；另外抗体抗原的匹配效果也是要考虑的

小金黎

我5ml的量，65%的功率超声5分钟，你觉得长了吗？抗原抗体匹配性问题应该不大。

314584385

10mg的胶乳在1.5mL的体系里进行活化？活化不充分，导至包被抗体不到位。

sktviolet

抗体是否匹配？还有就是优化偶联缓冲体系

leslie99

许多时候你内心在挣扎与彷徨，其实就是要么你没有意识到幸运飞艇某些方面是不对的，要么就是你错误的超级大乐透意识到某些方面是对的。在不知不觉间你就掉入了一个环，自己在错误的十一运夺金思想闭环里生活了很久，也许一年，也许很多年。