维生素D检测标准化进程

检验医师

近10年来, 越来越多的研究发现维生素D与心脏疾病、糖尿病、类风湿关节炎、多发性硬化症、帕金森氏障碍以及某些癌症之间存在着密切的联系[1]。随着临床实验室检测维生素D的需求量日益剧增, 一些体外诊断厂商推出了许多新的全自动检测25-羟基维生素D[25-hydroxyvitamin D, 25-（OH）D]的免疫学方法, 同时一些实验室也建立了以液相串联质谱（liquid chromatography tandem-mass spectrometry, LC-MS/MS）为代表的检测方法。但是, 随着检测的大范围开展, 临床实验室专家们发现不同检测方法间的结果明显不一致, 甚至结果的差异影响了临床对维生素D缺乏的诊断。

为了纠正这种情况, 2010年, 美国启动了维生素D标准化计划（the Vitamin D Standardization Program, VDSP）。我们介绍了国外维生素D检测标准化的相关内容以及进展情况。

一、维生素D的生化特性

维生素D是一种类固醇激素, 通过调节肠道吸收和肾脏重吸收作用维持机体的钙平衡。维生素D主要包括2种类型：维生素D2和维生素D3。维生素D3（胆钙化甾醇）主要通过人体皮下组织中7-脱氢胆固醇经紫外线B（波长295~315 nm）照射后转化合成, 因此维生素D也被称为“ 阳光维生素” 。维生素D2（麦角钙化醇）人体无法合成, 主要存在于部分植物中。

体内维生素D通过与白蛋白和维生素D结合蛋白结合后经血液运送至肝脏, 在肝脏分泌的25-羟化酶（25-hydroxylase, CYP2R1、CYP27A1）的参与下, 完成25号位的羟化过程并形成25（OH）D。在肾脏中, 25（OH）D进一步被1α -羟化酶（1 alpha-hydroxylase, CYP27B1）转化成具有生物活性的1, 25（OH）2D3（1, 25-dihydroxyvitamin D3, 又称骨化三醇）。

25（OH）D是机体维生素D的主要储存形式, 占总量的95%以上。由于其半衰期长（2 ~ 3周）, 并且不受血钙和甲状旁腺素水平的影响, 因此被公认为是客观评价维生素D营养状况的最佳指标[2]。

二、检测技术面临的问题

由于血循环中25（OH）D与结合蛋白的紧密结合（亲和常数高达1× 10^7~1× 10^9）, 准确定量维生素D必须先将其与结合蛋白彻底分离。目前市售的免疫学方法都有各自的专利方法分离维生素D和结合蛋白。最新的检测方法甚至包含特殊阻断剂, 能够有效减少样本中嗜异性抗体对检测结果的干扰。

对于LC-MS/MS而言, 沉淀样本中的结合蛋白并使用有机溶剂萃取维生素D是检测的必须步骤。由于大部分LC-MS/MS方法不能有效区分25（OH）D和其C3差向异构体[3-epi-25（OH）D], 因此会导至检测结果假性增高。虽然3-epi-25（OH）D主要存在于儿童体内, 成年人的含量较低, 但这种假性增高的结果会误导临床对维生素D缺乏的患者进行正确的诊断和处理[3, 4, 5, 6]。

2010年, 来自临床和实验室的专家们共同推荐25（OH）D的检测方法应能同时检测出25（OH）D2和25（OH）D3, 以保证来源于植物或动物的维生素D补充均能够被检测出[7]。因此, 临床实验室需要选择一种可以同时识别2种25（OH）D形式的检测方法。

三、维生素D检测方法间的结果差异

目前, 由于维生素D检测的标准化工作刚刚起步, 各种检测方法间存在着明显的结果差异, 尤其是商业化方法以及不同实验室的自建方法。研究发现检测结果存在差异的主要原因是检测抗体的特异性差异、解离结合蛋白的方法差异和嗜异性抗体的干扰[8, 9, 10] 。

临床实验室专家们都意识到检测25（OH）D与检测血脂、糖化血红蛋白和激素的情况类似, 由于不同方法使用的不同抗体直接导至了结果的不一致。例如：同一份样本使用维生素D2抗体识别率分别为80%和100%的不同方法检测, 结果必然不同。

类固醇激素与结合蛋白的结合度非常高, 因此在免疫反应前必须被完全解离和释放。不同方法使用的解离试剂均不同, 这可能直接导至患者的检测结果出现差异。

试剂厂商使用的标准物质的来源和质量也是造成维生素D检测结果出现差异的一个重要因素。厂商通常使用参考物质标定主标准曲线, 但提供给实验室客户的却是各自的校准品, 这直接导至了不同厂商间检测结果的差异。

四、维生素D标准化计划

为了解决维生素D检测面临的实际问题, 提供给临床更准确的信息, 保障患者的医疗安全, 美国国立卫生研究院（the National Institutes of Health, NIH）营养健康办公室（the Office of Dietary Supplements, ODS）与美国疾病预防控制中心（the Center for Disease Control and Prevention, CDC）、美国国家标准和技术研究院（the National Institute of Standards and Technology, NIST）和比利时根特大学一同合作, 启动了VDSP[11, 12, 13]。

建立VDSP的宗旨是促进全球所有实验室25（OH）D检测方法（包括商业化和自建方法）的标准化, 从而提高医疗安全, 保障全民健康。在此基础上, NIH-ODS提出了VDSP的4个主要目标：（1）标准化各种厂商和实验室自建的25（OH）D检测方法; （2）标准化全民营养健康调查所使用的各种25（OH）D检测方法; （3）实施致力于改进实验室25（OH）D检测方法性能的国际化研究; （4）研究并报道25（OH）D标准化后的结果差异。

标准化的实现必须具备3个关键要素：参考测量体系的建立、溯源性的建立和终端用户的检测性能保证。VDSP对于25（OH）D标准化的实现制定了3个具体步骤, 见图1。

（一）建立参考测量体系

VDSP的参考测量体系主要包括用于定值的参考测量程序（reference measurement procedure, RMP）、用于溯源性传递的SRM、评估检测方法性能的导则文件及认证程序、有准确度保证的PT/EQA计划。见表1。

1.参考测量程序

NIST和比利时根特大学先后建立了同位素稀释-液相串联质谱法（isotope-diluted-liquid chromatography tandem-mass spectrometry, ID-LC-MS/MS）检测25（OH）D[包括25（OH）D2、25（OH）D3和3-epi-25（OH）D]的参考方法[14, 15], 并被国际标准化组织认证并纳入检验医学溯源性联合委员会（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine, JCTLM）数据库中。

2.标准参考物质

目前NIST可提供SRM2972和SRM972用于25（OH）D检测方法的校准。由于互通性的问题, SRM2972仅适用于色谱或质谱法的校准。SRM972包含4份不同浓度的25（OH）D混合血清：水平1仅包含人血清, 以维生素D3为主; 水平2由人血清和马血清等比例组成, 含有较多的维生素D2; 水平3为服用维生素D2补充制剂的人血清, 含有等量的维生素D2和维生素D3; 水平4为添加了外源性3-epi-25（OH）D的人血清, 含有较多的3-epi-25（OH）D。SRM972适用于所有LC-MS/MS方法的校准。但对于免疫学检测方法, 由于外源性物质的基质效应影响, 仅水平1血清适用[16]。SRM972一旦用完, NIST将提供SRM972a作为补充。SRMs与用于准确度评估的PT/EQA物质具有互通性是VDSP的一个重要环节。2013年VDSP通过初步试验证明SRM972a、CAP和DEQAS评估物质具有较好的互通性[17] 。

3.性能验证程序

为保障25（OH）D检测结果的准确性, 2010年NIH-ODS与CDC合作建立了维生素D标准化认证程序, 并号召所有的生产厂商和实验室积极参与。该认证程序分2个阶段进行（见图2）, 首季度发放40份参考方法（JCTLM认证）定值的血清用于校准, 保证厂商或实验室自建方法的结果具有溯源性。随后, 每季度发放10份盲样样本用于精密度及准确度评估[18]。参加者连续4次的调查结果符合认证程序的要求即颁发认可证书, 有效期为1年。重新认证是1年1次, 维生素D的性能验证标准是平均偏差≤ 5%, 不精密度≤ 10%。

4.PT/EQA

在具有准确度的PT/EQA计划中, 目前可供选择的有英国的DEQAS和CAP的基于准确性的维生素D计划（the Accuracy-based Vitamin D Program, ABVD）, 均为收费服务, 通过评估样本对实验室25（OH）D检测结果的准确性进行评定, 并发放合格证书。DEQAS按季发放含不同浓度维生素D代谢产物的人血清样本, 样本中25（OH）D2、25（OH）D3和3-epi-25（OH）D3经参考方法进行定值[19]。CAP-ABVD配制含不同浓度25（OH）D2和25（OH）D3的人血清混合样本, 并用LC-MS/MS（可溯源至RMP）进行定值[20]。此外, 实验室还可以参加NIST-NIH组织的VitDQAP项目。该项目对任何想要参加的实验室免费开放（http：//www.nist.gov/mml/csd/vitdqap.cfm）, 每年在夏、冬两季发放评估样本。此项目不对参加实验室进行评分, 仅提供综合性的数据分析报告, 同时NIST的专家们可以为实验室提供技术支持, 帮助实验室发现并纠正检测方法中的问题。

（二）建立商业化方法和实验室自建方法检测结果的溯源性

大部分临床实验室都使用商业方法来检测25（OH）D。因此商业化方法在整个VDSP中扮演着至关重要的角色, 见图3。VDSP倡导所有厂商均应积极参与到标准化计划中。目前, 大部分的厂商已使用NIST的SRM对其方法进行校准, 并且参加了美国CDC的标准化认证程序, 保证了检测结果的准确性。美国CDC甚至计划在其官网上颁布获得认证的检测方法名录, 以此促使所有厂商均参与到VDSP中。VDSP希望在RMP、厂商和实验室间建立一条坚不可摧的溯源链, 使检测结果与RMP一致, 从而保证检测结果的真实可靠[21]。

一些大型的临床实验室在自建25（OH）D检测方法时也开始使用SRMs, 并参与到标准化认证程序中, 以保证自建方法的准确性。但美国CDC的计划太过昂贵, 且认证有效期仅有1年, 需要持续的长期参与, 因此并不是常规临床实验室或研究所的实用解决办法。对于这些实验室, 可参加有准确度保证的PT或EQA计划, 并根据反馈结果进行调整, 以此来保证结果的准确性。

（三）验证“ 终端用户” 的方法性能

为保证“ 终端用户” 的检测结果可以溯源至RMP且具有可比性, VDSP要求开展25（OH）D检测的各类实验室需要对所选择的检测方法定期进行分析性能验证, 并符合VDSP倡导的评价标准[22], 见表3。此项工作可以通过参加美国CDC的维生素D标准化认证程序或具有准确度保证的PT/EQA计划来完成。

五、结论

经过4年的努力, VDSP取得了实质性的进展。参考测量体系的完善, 使越来越多的厂商和大型临床实验室加入到美国CDC标准化认证程序的行列中。CAP、DEQAS和VitDQAP参加实验室数的与日俱增, 使其获得了更全面的数据, 得以改善VDSP的进一步规划。但要达到全球25（OH）D检测结果一致的目的仍然任重而道远, 尤其是以往的研究结果与各类公共健康导则的修正问题。如何跨越这一障碍, 需要临床专家、实验室专家以及VDSP相关人员的共同努力。

参考文献略

作者：周琰, 潘柏申       

单位：复旦大学附属中山医院检验科

来源：检验医学杂志