凋亡检测操作流程

流式小生

一、Annexin V 检测凋亡细胞膜的改变

试剂及溶液：

A 对于单独购买的试剂：

   a) 10X Binding Buffer （货号：556454）
   b) Propidium Iodide（PI，货号：556463）：建议与以下试剂同时使用 Annexin V-FITC（货号： 556420,556419）或 Annexin V-Biotin （货号： 556418，556417）
   c) Via-Probe? （货号：555816 ）：核酸染料7-AAD。建议与以下试剂同时使用Annexin V-PE（货号：556422，556421）或Annexin V-Biotin（货号：556418，556417）。
   d) 1X PBS Buffer （货号： 554781）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4 7H20, 0.24 g KH2PO4 ,加水至1L。 调整pH值至 7.2。 高压灭菌室温保存。

B．对于凋亡检测试剂盒（货号：556547）

   a) FITC Annexin V （组分编号： 51-65874X）：每个样本5 μl用量。
   b) Propidium Iodide （PI，组分编号： 51-66211E)）：现成的核酸染料。每个样本5 μl用量。
   c) 10X Annexin V Binding Buffer（组分编号： 51-66121E）

操作步骤：

  1. 取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
  2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1xBinding Buffer缓冲液制成1x106细胞/ml的悬液。
  3. Falcon试管中加入100μl 细胞悬液。
  4. 按以下体积加入AnnexinV与核酸染料：

管号	名称	荧光标记 Annexin V	核酸染料：
1	阴性对照	——	——
2	单阳1	AV FITC	——
3	单阳2	——	PI
4	样本	AV FITC	PI

  5．轻轻混匀，室温（20°C ~25°C）避光处放置15分钟。
  6．*使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时:
    ● 1xBinding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。
    ● 1xBinding Buffer缓冲液100μl溶解SAv-FITC试剂0.5μg，加入到细胞管中。
    ● 轻轻混匀。加入5μl PI，室温（20-25°C）避光处放置15分钟。
  7．各试验管中分别加入1xBinding Buffer缓冲液400μl。1小时内上流式细胞仪测定结果。

Annexin V Blocking

待测细胞与未标记的重组Annexin V预孵育，然后进行实验，是Annexin V细胞凋亡检测的质量控制。原理是预先阻断Annexin V-FITC的结合位点，这样可以证明Annexin V-FITC凋亡分析的特异性。

   1. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1xBinding Buffer缓冲液制成1x106细胞/ml的悬液。
   2. 在5ml的培养管中加入100μl细胞悬液（约1x105个细胞）。
   3. 加入5-15μg纯化的重组Annexin V。注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其Annexin V位点饱和所需要的纯化的重组Annexin V含量不同。某些情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，0.5x105个细胞加5-15μg纯化的重组Annexin V。
   4. 轻轻混匀，室温反应15分钟。
   5. 加入5μl的Annexin V-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。
   6. 各试验管中分别加入1xBinding Buffer缓冲液400μl。
   7. 1小时内上流式细胞仪测定结果。

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