“微滴式数字PCR”——撬动“液态活检”的支点！

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曙光初现，数字PCR的商业级应用

和群体医疗不同，个性化医疗又被称为“精准医疗”，始作俑者或者说背后最大的推手，是进行药物开发与生产的各大医药公司。这些“个性化定制”药物研发的基本思路是以基因组学为基础，结合各种“组学”水平上的信息，研发出针对各种特定基因的“靶向药物”。例如乳腺癌治疗中针对HER2的赫赛汀（Herceptin）、非小细胞肺癌中针对EGFR的易瑞沙（Gefitinib）等等。

由于这些“个性化药物”在研发之初就以特定靶点为导向，所以决定了肿瘤的个性化医疗大体上包括2个阶段：治疗前的诊断与其后的治疗过程。前者回答的问题是病人能不能用对应的靶向药物；后者涉及的问题是如果能用，怎么用？其实把第一个阶段称为传统上的“诊断”不太准确，这个阶段的工作本质上是对每个已经确诊的病人进行基因组水平的分析，所以现在用“伴随检测”描述第一个阶段更为合理，因为这种检测是伴随着靶向药物而展开的、对特定基因突变与否等情况的分析。全球层面来看，QIAGEN、Roche和Abbott等这几家公司都从“药物——伴随检测”潮流中受益匪浅。

对于肿瘤而言，检测的样本必须是病灶组织，伴随检测也不例外。这时对伴随检测有两只拦路虎必须拿下：1，肿瘤的异质性问题（异质性又分为空间和时间两个层面）；2，肿瘤组织并非那么容易取得，尤其在治疗过程中对实体瘤的re-biopsy常常是mission impossible的。

第一，如果通过穿刺或者手术拿到病灶样品，原理上每块病理切片都是病灶的三维空间内独立并唯一的区域，肿瘤组织并非铁板一块，其中有正常的细胞, 也有不同的肿瘤细胞，所以如何保证一张病理切片能反应整个病灶的情况?

第二，由于肿瘤异质性的特点，病人会随着抗癌药物的使用产生耐药性。那么对于二线、三线抗癌药物的伴随检测就更难，因为这种状况下通过手术再取得病灶样品的比例进一步降低，如果通过一些创伤性的方法病人会由于过于痛苦而拒绝接受。这也是肿瘤治疗过程中耐药监控、微小病残留等等面临的时间层面异质性问题。

于是在Oncology的领域，“液态活检”（ liquid biopsy）的概念浮出水面。在西方被称为“检测领域的圣杯”。在2015年第一季度，“液态活检”已被MIT明确列为2015的十大突破技术，此时距离2015年结束还有整整3个季度。为什么2015年还未到头“液态活检”已经笃定当选?

“液态活检”的概念其实就解决了一个问题：新的检测样品。因为以“血液循环肿瘤DNA”（cfDNA或ctDNA）为检测对象，能很好地克服部分情况下病症组织难以获得的困境，样品的收集是无创或微创的，可以随时采样，对病灶相关biomarker实时掌握，解决了肿瘤进展及治疗过程中时间维度上的异质性；血液内的ctDNA能综合地反映肿瘤整体情况，排除空间上的异质性。目前已经有相当数量的文献对于不同肿瘤的研究证实，血液ctDNA的检测与组织样品的检测呈现非常好的相关性，换句话说，通过血液样品中ctDNA的分析能够反映病灶肿瘤细胞的整体水平。

虽然“液态活检”的概念很好，技术难点也显而易见：cfDNA本身高度片段化，血液内含量非常低，约5~50ng/ml血浆，且其中99%的DNA是野生型的。现有检测手段的灵敏度往往不够，根据2015年7月31日国家卫计委个体化医学检测技术专家委员会制订的《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》，各项技术的灵敏度如下：毛细管电泳测序约20%；NGS约10%；焦磷酸测序约10%；定量PCR约10%，ARMS部分检测方案可达0.1%，QX200微滴式数字PCR可轻松到达万分之几的水平，检测灵敏度方面数字PCR的优势明显。这种情况下微滴式数字PCR作为一种全新技术，天然地与“液态活检”的概念捆绑在一起。“液态活检”提出了新的检测对象，“微滴式数字PCR”为这种新的检测对象提供了革命性的检测方法。

那么数字PCR检测的重复性怎么样？目前而言liquid biopsy主要的形式还是血液，对于血液内存在的抑制剂，数字PCR的耐受性如何？美国Fred Hutchinson癌症研究中心发表的2篇文章很好地回答了上面的疑问，夯实了ddPCR用于ctDNA检测的方法学基础，这两篇文章的重要性在日后会逐渐显现出来。（分别是上期推荐的十篇数字PCR文献中的第8、9篇）

Tolerance of Droplet-Digital PCR vs Real-Time Quantitative PCR to Inhibitory Substances (Clinical Chemistry 59:11 (2013))

这项实验系统比较了微滴式数字PCR和传统定量PCR对SDS、EDTA、Heparin（肝素，血液抗凝剂）等常见PCR抑制物的耐受程度。通过计算和比较两种平台的抑制曲线和最大抑制浓度中值（IC50）表明，微滴式数字PCR对SDS、肝素的耐受度高于定量PCR。

Absolute Quantification by droplet digital PCR versus Analog real-time PCR (Nature Method, 2013)

Nature Method上发表的文章证明了微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）能用于不同情况下准确、可重复性的血浆和血清中microRNA的量化检测，这将为miRNA及其它核酸类循环生物标志物的检测铺垫了道路。

为了评估每个工作流程的步骤，包括连续稀释准备、反转录（RT）和PCR扩增，实验团队分别在三个独立的工作日中，通过ddPCR嵌套分析对比定量PCR，对水和血浆中6种不同的合成miRNA各稀释系列的cDNA进行分析，结果发现相较于qPCR，ddPCR具有更高的精确度（变异系数可降低48-72%）。

实际上，以ctDNA检测为核心的肿瘤个性化医疗组成了一个生态圈。最上层的是各肿瘤学研究实验室和全球性的药企以及政策法规的制定者（如FDA、CFDA）；居于中间的是各种检测方案提供商或检测项目的服务商，包括了第三方检测机构、试剂盒开发商等等；终端用户是医院病理科及各相关科室。政府的专业机构制定政策及法规；超大药企（或制药公司与实验室合作）根据各自的药物决定具体伴随检测的种类与项目；终端病患是靶向药物和配套的伴随检测的受益者。居于中间的服务商直接决定了药企到病患的传递效率。

居于中间环节的部分是中国企业可以着重发力的地方，这也是数字PCR技术发展至今最明确的商业级应用领域，更是一部分企业赶超传统行业的机会所在：荧光定量PCR技术造就了达安基因、匹基生物（后被QIAGEN收购）这样的龙头企业；NGS技术的成熟雨后春笋般地催生了贝瑞和康为代表的一批公司，目前还处于中原逐鹿的阶段；那么在数字PCR的液态活检市场中谁会脱颖而出呢?

狄更斯的名句：这是最好的时代，这是最坏的时代！对于数字PCR在液态活检中的应用，先知先觉者们会觉得这是最好的时代。如果问这个市场有多大？答案是无限大！因为照Peter Drucker的说法，企业经营的目的只有一个：创造客户。

来源：数字PCR的可能性  作者： 陈寅清