特定蛋白项目的临床应用与检测的质量控制

检验医师

血浆蛋白成分至少有1000多种，已分离出的具有临床意义的纯品有100多种，其中许多蛋白具有特定的抗原性，可以采用抗原抗体反应的方法，对血液、脑脊液、尿液等标本中的这些蛋白进行检测，故习惯称其特定蛋白。这些特定蛋白在机体内具有某种生理功能，当疾病状态时又具有重要的病理意义。目前可以通过专业的特定蛋白分析仪或生化分析仪对其分析，为临床提供有效的病理生理指标，并作为临床诊断、治疗效果和分析预后的依据。

一、特定蛋白项目的临床应用

         目前已用于临床诊断的特定蛋白多达40~50种，涉及免疫球蛋白及补体系列、风湿及类风湿系列、尿微量蛋白系列、急性炎症蛋白系列等。主要分类及其临床应用如下：

1. 免疫球蛋白及补体系列：IgG、IgM、IgA、补体C3、补体C4、IgG、IgA、IgM的检测有助于了解机体抗感染能力。在免疫复合物疾病中，C3、C4检测可以了解其消耗程度。

         适应症：①免疫力低，反复感染患者；②自身免疫性疾病；③多发性骨髓瘤；④慢性肝病；⑤非何杰金氏淋巴瘤；⑥白血病；⑦良性单克隆免疫球蛋白病；⑧先天性或获得性低免疫球蛋白血症；⑨对白、球蛋白比例异常者；⑩术后感染，移植排斥反应。

2. 风湿及类风湿系列：抗链球菌溶血素(ASO)、类风湿因子(RF) 、C-反应蛋白(CRP)

         RF是抗变性IgG的抗体，常见于类风湿性关节炎患者的血清和滑膜液中，其定量测定是判断患者免疫应答和观察疗效的一个重要指标。CRP对类风湿炎症反应具有辅助的诊断作用。ASO可用于风湿热和风湿性关节炎的鉴别诊断。

         适应症：①风湿性疾病；②类风湿关节炎；③骨关节炎与类风湿关节炎的鉴别。

3. 尿微量蛋白系列：尿微量蛋白(MA)、尿转铁蛋白(TRU)、尿免疫球蛋白(IgU)、α1-微球蛋白(A1M)、β2-微球蛋白(β2MG)

         肾小球性蛋白尿是由于肾小球滤膜通透性增加或(和)滤膜上负电荷减少所至。如果尿蛋白排出增多，但低分子量蛋白为主，如MA、TRU等，称为选择性蛋白尿；若高分子量的蛋白排出增多，如IgU等，称为非选择性蛋白尿，后者表示病变严重。肾小球性蛋白尿可见于肾小球肾炎、糖尿病、自身免疫性疾病和肿瘤等。

         肾小管性蛋白尿系肾小管重吸收功能障碍所致，主要是小分子蛋白排泄增高，如β2MG、A1M。可见于肾孟肾炎、失钾性肾病、肾血管性疾病及重金属中毒等。

         适应症：①病程超过5年的胰岛素依赖型糖尿病患者；②糖尿病合并高血压患者；②肥胖型非胰岛素依赖型糖尿(NIDDM)患者；④接触肾毒性物质，接受肾毒性药物治疗的患者；⑥可疑肾病或有肾病危险因素的患者。

4. 急性炎症蛋白系列：C-反应蛋白（CRP）、α1-酸性糖蛋白(AAG) 、触珠蛋白(HPT) 、铜兰蛋白(CER) 、α1-抗胰蛋白酶(AAT)

         在炎症和组织坏死时，血浆某些蛋白会出现特征性变化，称为急性炎症时相反应。CRP、AAG、HPT、CER和AAT是五种急性炎症时相蛋白，其在急性损伤早期就可表现出含量升高。这些指标比传统指标如发热、白细胞升高及分类异常、血沉加速等，能更早的反映炎症和感染情况。另外，急性炎症时相蛋白增加的持续时间不一样，有助于准确判断炎症的发展过程。其中CRP最为敏感，在炎症发生的最初2小时内含量就会增加；HPT在48小时内明显升高；AAG是疾病恢复的极好指标；而CER经常与HPT、AAG一起检测，有助于对急性炎症时相反应的监测。

5. 多发性骨髓瘤检测：κ-轻链(KAP)、λ-轻链(LAM)

         游离轻链又称本周氏(Bence-Jonese)蛋白，是由浆细胞无性繁殖合成，它分为KAP型和LAM型两类。游离轻链与骨髓瘤的关系最密切，约20％的骨髓瘤患者只分泌游离轻链，约50％的骨髓瘤患者既分泌免疫球蛋白，又分泌游离轻链，而前者预后较差。在预后方面，以LAM增加为主的类型，要以KAP增加为主的类型要差。在肾功能正常的情况下，游离轻链的定量对骨髓瘤的诊断、分期及预后判断均有参考价值。

6. 营养状况检测：白蛋白(ALB) 、前白蛋白(PAB) 、转铁蛋白(TRF)

         患者的营养状况可极大地影响预后和住院期限。对患者的营养状态，可以用ALB浓度来评价，但是由于其含量高，半寿期长(20天)，用于营养状态监测的灵敏度偏低；但PAB(半衰期为2天)，TRF(半衰期为8天)，在营养不良情况下，二者也都能快速表现出含量的下降。目前，临床普遍联合使用ALB、PAB及TRF三项指标，用于营养状况的评价和治疗效果的监测，保证结果更加灵敏准确。另外，PAB在肝脏合成，半寿期短，又可作为早期肝功能损伤的指标。

7. 神经系统疾病检测：IgG、IgA、IgM

         对血脑屏障完整性的评价以及对椎管内炎性病变的诊断，均需依赖脑脊液(CSF)的检查。CSF中IgG水平升高见于多发性硬化症、病毒性脑膜炎和脑炎、细菌性脑膜炎、脑脓肿及大脑硬膜外脓肿等疾病。

8. 血液病检测：转铁蛋白(TRF) 、触珠蛋白(HPT) 、铁蛋白(FER) 、抗凝血酶-Ⅲ(AT3)

         TRF可用于缺铁性贫血和溶血性贫血的鉴别诊断。影响铁代谢或造血的因素都可间接地影响转铁蛋白的水平。HPT可辅助铁的储存，其水平下降可见于严重血管内溶血。FER是检查体内铁缺乏的最灵敏的指标，缺铁性贫血、失血以及长期腹泻造成的铁吸收障碍可以导至FER降低。AT3是具有抑制凝血作用的血浆蛋白，是提示血栓形成危险性的重要指标。

二、特定蛋白项目的常规检测方法

         随着越来越多的特定蛋白被应用于临床，其检测方法也发展迅速。在1959年之前，一直采用经典免疫沉淀方法进行检测，这存在测定范围窄、灵敏度低、繁琐费时及不能自动化等缺点。1959年，Schultze等报道了透射比浊法（Transmission Turbidimetry）。这种方法是常用于生化指标的测定，用于特定蛋白检测，却存在灵敏度偏低和测定范围较窄等问题。近年来，在免疫比浊法的基础上又出现乳胶增强比浊法。该方法是利用微小的乳胶颗粒(1μm±)联接抗体后，在液相中和相应抗原结合后产生光吸收或光散射的变化等来测定抗原含量，这特别增强了免疫比浊法检测特定蛋白的性能，其灵敏度可以提高1000倍以上，同时其受到非特异性反应的影响也大大减少，因而精确度和重复性皆较好。

         1967年，Ritchie等提出了终点散射比浊法（End-point Nephelometry），该方法与免疫沉淀方法、透射比浊法相比，灵敏度高、重复性好、测定范围宽，但该法测定的仍是抗原抗体反应的第二阶段，即出现肉眼可见反应的阶段，不适合快速检测；同时该法易受反应本底干扰，待测抗原的含量越低，本底干扰就越大。后来出现了终点散射比浊法的一种改进方法，即定时散射比浊法（Fixedtime Nephelometry）。该方法的基本原理是与终点散射比浊法相似，测定也是抗原抗体反应的第二阶段，但在测定散射信号时不与反应开始同步，而是推迟几秒钟用以扣除抗原抗体反应的不稳定阶段，从而将这种误差影响降至最低。其过程是：在抗原抗体反应开始时，留出预反应时间，即散射光信号第一次读数在反应开始的7.5秒至2分钟内，大多数情况下2分钟以后测第二次读数，并从第二次测信号值扣除第一次读数信号值，从而获得待测抗原的信号值并通过仪器处理转换为待测抗原浓度。 1977年，Sternberg等提出了速率散射比浊法（Rate Nephelometry），该检测法可测抗原抗体结合反应的第一阶段，即尚未出现肉眼可见反应的阶段，能够进行快速检测，使免疫化学分析发生了质的飞跃。相比以前的检测方法，速率散射比浊测定是一种抗原抗体结合的动态测定法，是在抗原抗体结合反应的第一阶段，测定其复合物形成的速率（速率法），达到检测更快速准确的目的。

         目前，免疫比浊法已经成为检测体液中特定蛋白的一种微量、快速、自动化检测的常规免疫化学分析技术。根据这一原理来设计的专业分析系统，具有广泛的测定范围，从而广泛的适用于血浆、血清、脑脊液和尿液多种样本。同时该系统还可以进行抗原过量监测，可以检测非特异性反应异常的样本等。此外，它还有专门配套设计的试剂，保证了结果的稳定可靠。这些既符合实验室免疫检测和临床发展的需要，也适合流程管理和质量系统的优化。

         对广大临床和检验工作者来说，在做好特定蛋白检测的质量控制，保证结果准确性的同时，还应对这些特定蛋白的临床应用价值，与疾病发生发展之间的关系，以及可能影响正确检测的因素，有较全面的了解，才能更好的利用这些指标，为疾病诊断和协助治疗提供更好的服务。

三、特定蛋白检测的质量控制

        由于特定蛋白检测项目逐渐增多，对其技术程序的标准化，诊断试剂的标准化和常规实验的质量控制已是日益重视。由于特定蛋白形式多样、结构复杂、功能不一，以及免疫检测方法中可能出现的由钩状效应造成假阴性等问题，给特定蛋白检测提出了特别要求。通过专业的特定蛋白分析系统的使用，强化了质量控制，提高了检测质量，大幅度的防止漏检、误诊的发生。

         在应用免疫比浊法检测特定蛋白的质量控制中，要考虑主要因素包括：

        1. 免疫反应因素：抗原、抗体、反应介质

        2. 特定蛋白分析系统的系统性：仪器、试剂、检测程序、校准品及质控品

        3. 钩状效应导至假阴性的识别

         据有关质量监督部门调查的结果来看，很多实验室测定结果的差异较大，其中一个重要的原因是没有采用一致的参考品进行校准。第1代参考品(即1967年推出的批号为67／86的WHO免疫球蛋白标准品)能很好地用于免疫扩散和火箭电泳测定的标准化，但由于其有些浑浊，就不太适用于免疫比浊法。因此，IFCC委托一个研究小组建立了用来制备新一代国际人血清蛋白参考品(RPPHS)的方法，即在严格控制的条件下收集血清，在冻干之前用硅吸附去除脂蛋白。有许多实验室参加了对白蛋白、a1-酸性糖蛋白、a1-抗胰蛋白酶、铜蓝蛋白、触珠蛋白、a2-巨球蛋白、转铁蛋白、C3、C4、IgG、IgA、IgM和CRP的测定，与较早的参考品值比较，新参考品改变了某些蛋白的浓度，如a1-酸性糖蛋白、a1-抗胰蛋白酶和IgM。研制RPPHS的目的是用其来校准用于血清蛋白常规测定的第三级参考品，RPPHS可从美国CAP获得。

         当前比较流行的特定蛋白的国际标准是CRM-470，其目标是使一个样品在全世界得到一个相同的结果。为此要建立新的国际第二级具血清介质的参考品，用作14种血浆蛋白检测的参考，以后将有更多蛋白被定值。1989年国际临床化学学会(IFCC)会同美国病理学会(CAP)，在与各重要厂商(Abbott、Beckman、Behring等)协商后，指定由Behring公司负责制备国际参考品。按照IFCC定值方案，统一使用指定的各特定蛋白纯化标准为原始标准，避免各实验室因使用的标准不一致造成定值差异，方案详细规定了定值的操作程序以及统计方法。例如，为确保在检测时各标准，样品间无基体效应的差异和没有抗原过剩，要求回归线通过零点，标准和测定都须做多个稀释（须以重量法校正），每个稀释样品做双份检测等。这使27个定值实验室（欧洲、美国和日本）步调一致，在规定期限内完成定值。允许的测定方法为：免疫透射比浊、免疫散射比浊和放射免疫扩散。在1992年欧洲经济共同体的共同体参考局(BCR)认可该参考品，并给予代号CRM-470（认可参考品470）。

         使用CRM-470标准后，各重要厂商(Abbott、Beckman、Behring等)都已签署认可CRM-470作为他们公司的第一标准，这带来了一系列的良好效果，如实验室结果的可比性得以改善；依赖方法偏差很低；任何时候任何人可以用；血清蛋白的化学物理特性很好；成年人的参考范围的一致性；液体和尿液的分析也可以得到改善。近年来，其它非签署公司要对自己的校准品定值时，已经形成采用上述公司的特定蛋白检测系列，按照数值传递实验方案，对本公司校准品定值。然后再以患者样品和认可的上述公司检测系列作方法学比较，确认传递的可靠性，再将产品系列推向市场。

         值得注意的是，由于免疫方法检测的特殊性，抗原过量的监测是检测结果的质量控制的另一个重要保证。为了保证检测结果的准确性，检测系统应在检测中保证抗体恒定过量，即反应结束后，反应介质中有游离抗体存在，而无游离抗原存在。保证抗体恒定过量，最好的方法是在反应过程完成时，再加入已知相应抗原到该反应介质中，如新加入抗原可与游离抗体结合反应，则产生新的速率峰值，由此证明之前检测到的速率峰信号是由待测抗原完全反应产生的；若新加入抗原后不出现新的速率峰，则说明反应介质中无游离抗体存在，即可能出现待测抗原尚未完全反应，那么之前的速率峰信号可能不是在抗体恒定过量的条件产生，可能受到钩状效应的影响，结果不可靠，需将待测样品进一步稀释后重测。该设计是真正的抗原过量监测，能完全保证检测结果的真实准确可靠，以美国Beckman公司特定蛋白分析的专利设计为例，示意图如下：

         特定蛋白可为临床提供有效的病理生理指标，作为临床诊断、判断治疗效果以及分析预后的依据。选择最优的方法学和专业的检测系统，是保证检测结果准确的首要前提。目前随着国内外对特定蛋白检测标准化的重视，特别是更加有效的参考品的出现，有力地促进了特定蛋白检测的质量水平的提高。

         对广大临床和检验工作者来说，在做好特定蛋白检测的质量控制，保证结果准确性的同时，还应对这些特定蛋白的临床应用价值，与疾病发生发展之间的关系，以及可能影响正确检测的因素，有较全面的了解，才能更好的利用这些指标，为疾病诊断和协助治疗提供更好的服务。

         来源：检验地带网