高敏C-反应蛋白 (hsCRP)

检验医师

C-反应蛋白（CRP）最初在1930年作为急性炎症患者血清中与肺炎球菌C多糖反应的物质被Tillett和Francis发现。人CRP属于一个非常保守的蛋白家族，命名为“正五聚蛋白”，其特征是钙依赖的配体结合，以及5个单体形成一个径向对称的环结构[1]。CRP含有224个氨基酸残基，单体的分子量为大约25 kDa，理论等电点为6.4[2-5]。单体非共价地结合为五聚体结构。

几十年来，CRP被认为是肝脏产生的蛋白。然而，最新数据表明CRP在其他组织，例如血管壁和冠状动脉平滑肌细胞中也有相当表达，且可能不同于血浆中占绝大多数的天然五聚体形式而以单体形式存在[2-5]。

CRP在人体中的确切功能仍在讨论中。经证实这个蛋白参与了炎症及先天性免疫过程。CRP的重要生理活性取决于它与各种配体的结合能力，例如损伤的细胞膜、凋亡细胞、纤连蛋白等等，而它与胆碱磷酸残基的亲和力最强。当CRP结合配体以后，它可以被补体成分C1q识别，从而激活经典补体途径。CRP通过与补体因子H的相互作用来调节补体旁路途径[7]。

尽管CRP的特异性不是很高，但C-反应蛋白在临床上仍被作为主要的炎症标记物。健康人中，CRP水平通常低于5 mg/L。病理学中，CRP浓度有一个高达10,000倍的动力学范围（约0.05–500 mg/L）[8]。CRP的高水平（超过30 mg/L）出现在细菌感染中，例如化脓性关节炎、脑膜炎和肺炎。轻度升高的CRP（约10-40 mg/L）则在心肌梗死和其他类型的组织损伤后出现。

2003年，美国疾控中心（CDC）和美国心脏病协会（AHA）发表声明，确认CRP为目前临床实践中评估心血管风险的最佳炎症标记物[9]。许多流行病学研究表明CRP是将来心血管突发症的强有力的独立预测指标，包括心肌梗死、缺血性中风、末梢血管疾病以及未知病因的心源性猝死（Clearfi eld等概述[10]）。CDC/AHA指南支持使用CRP进行初级预防，并根据相对风险设定了参考值：低风险（<1.0 mg/L）、中度风险（1.0-3.0 mg/L）和高风险（>3.0 mg/L）。这就是为什么现今高敏CRP（hsCRP）检测系统力争达到纳克/毫升（ng/ml）的检测限，而缩写hsCRP也成为此系统中被检测蛋白的正式名称。血浆CRP水平和急性冠状动脉综合症患者死亡风险的紧密关系已被证实[11]。而且，Koenig等人[12]报道了循环血hsCRP浓度的升高会导至几种常见慢性病的死亡风险升高。

新型免疫检测系统搭配 HyTest公司生产的独特单克隆抗体，取得了很好的灵敏度。磁性生物传感器的检测线性范围为0.025 mg/L到2.5 mg/L[13]；而化学发光分析的线性范围为0.01 mg/L到50 mg/L[14]（两种方法的检测下限都是0.004 mg/L）。使用纳米晶体的固相夹心荧光免疫检测系统可达到检测限0.0011mg/L[15]。我们的最优抗体配对C2-C6和C5-CRP135以及其他的几个配对可在实验性荧光免疫检测系统中达到10,000倍的线性范围。

这些配对可用于不同诊断平台hsCRP检测系统的开发。传统的CRP检测系统通常使用比浊法和竞争法，倾向于使用亲和力相对较低的单抗。为了顾客之便，我们制备了不同亲和力的单克隆抗体，以便应用于不同类型的免疫检测系统。

1. 人CRP

来源： 人胸／腹液体或血浆。组织捐献者的血液样品未检出乙肝，艾滋病-1和艾滋病-2抗体，丙肝病毒及梅毒。
纯度： >95%
物理状态： 溶液，含0.3 M NaCl，0.05%叠氮钠，20 mM Tris，pH 8.0
应用： 生产抗体用免疫原、CRP免疫学和分子量标准品、CRP生物化学和免疫化学研究
保存： +4℃


2. 抗CRP单克隆抗体

宿主动物： Balb/c小鼠
融合用细胞系： Sp2/0
抗原： 人CRP
提纯方法： 蛋白A亲和层析
物理状态： 单抗溶于PBS，并含有0.1％叠氮钠
应用： 不同类型的定量CRP免疫检测、CRP免疫印记检测、CRP免疫亲和纯化、免疫组化

杂交瘤细胞由Sp2/0骨髓瘤细胞和经纯化的人CRP免疫的Balb/c小鼠的脾细胞融合而产生。

2.1. 应用

在天然CRP分子中，每一个分子含有两个配位的钙离子[17]。我公司同时提供对溶液中钙离子的缺失敏感和不敏感的抗CRP单抗。有些抗体只在钙离子存在时识别抗原（克隆C3、C4）。大多数克隆在夹心免疫检测中不依赖钙离子，甚至能在样品中存在EDTA的情况下识别抗原（克隆C1、C2、C5、C6、C7、CRP11、CRP30、CRP36、CRP103、CRP135、CRP169）。
我公司所有CRP单抗都通过不同的免疫应用测试。

2.1.1. 直接酶联免疫吸附分析
我公司所有的CRP单抗都经直接法ELISA分析，所有的抗体都能高度灵敏地识别天然CRP。
大多数抗体都能分别在钙离子存在和不存在时识别CRP，克隆C3只能在钙离子存在时识别CRP（图1和图2）。





2.1.2. CRP Western blot检测
抗原转移到硝酸纤维素膜上以后，克隆C1、CRP11、CRP36和CRP169都可在WB中识别人CRP。图3为使用克隆CRP36和CRP169免疫印记检测CRP的实验结果。



2.1.3. 高敏CRP夹心免疫检测系统
所有的单抗都在夹心荧光免疫法中作为捕获抗体和检测抗体，在有/无钙离子的情况下用正常人血清测试。我们推荐的最佳配对为（捕获抗体–检测抗体）：
C2 – C6
C5 – C6
C7 – C6
C5 – CRP135
CRP30 – CRP135
C3 – C6 (Ca2+-sensitive assay)
C2 – C4 (Ca2+- sensitive assay)
图4和图5分别为配对C2-C6和C5-CRP135的代表性校准曲线。我公司的单抗可以高度灵敏地识别CRP抗原，并具有良好的反应动力学；线性范围超过10000倍。




尽管多数推荐的配对不受EDTA的影响，却有个别配对对溶液中EDTA的存在敏感（图6）。C5-CRP135等在有/无钙离子的情况下都可使用，而C3-C6配对则对钙离子有强烈的依赖性。



2.1.4. 亲和力信息
对于某些应用而言，例如比浊法和免疫竞争法，需估算所用抗体的亲和常数。我公司提供一系列不同亲和力的单抗（图7和表1），并使用Biacore&#174;技术测出了某些CRP单抗的亲和常数。Biacore技术是基于表面等离子体共振效应，它能够实时测量两个大分子间的相互作用。结合和解离速率可显示在屏幕上，从而可计算出亲和常数。




3. 去C-反应蛋白血清

来源： 正常人血清
纯化方法： 免疫亲和层析
物理状态： 冰冻液体
保存： -20℃

去C-反应蛋白血清是用正常人血清通过免疫亲和层析制备。亲和吸附剂的基质使用了三种识别抗原不同位点的单克隆抗体。根据酶免吸附分析检测结果，去C-反应蛋白血清中的抗原浓度低于0.02 ng/ml（图8）。去C-反应蛋白血清可作为制备标准品和校准品的基质。




来源：hytest