深部真菌病的实验诊断进展

检验医师

作者：吴真， 徐晓刚  来源：微生物之家

　　深部真菌病指除表皮、毛发、甲床以外，真菌侵犯内脏、皮下组织和黏膜所致的感染，其发生取决于外界致病因素和人体免疫力的相互作用。常见的病原真菌有念珠菌、曲霉、隐球菌等。近年来，随着广谱抗生素等药物的广泛应用及免疫抑制剂人群的增多，真菌感染不断增多，已成为应用免疫抑制患者及其他危重病患者的主要死亡原因之一。据最新统计，每年全球有100万艾滋病患者罹患隐球菌脑膜炎，其中70%在3个月内死亡。

　　真菌感染的预后有赖于早期治疗，研究显示早期治疗可以提高生存率。日本一所教学医院收集77例怀疑为深部真菌病的病例，62%早期治疗患者的临床症状和血清学检查提示疾病有好转，而非早期治疗的患者相关改善率仅为21%。遗憾的是，深部真菌病早期诊断困难，在缺乏依据的情况下，加用抗真菌药物不仅增加治疗成本和患者负担，也增加了发生不良反应的风险。因此，深部真菌病的早期检测与鉴定受到临床的重视。现就目前深部真菌病诊断方法作一综述。

　　一、直接镜检、培养和组织病理学检查

　　一般取痰液、尿液、胸腹腔积液、脑脊液、活检组织等作标本，直接涂片是真菌学检查最经典的方法，具有快速、简便的特点，且可以根据特征性形态区分念珠菌、隐球菌、结核菌等。无菌体液、皮下组织和各类活检组织标本中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断，如脑脊液墨汁涂片中发现带有荚膜的隐球菌孢子、组织标本中发现真菌菌丝及孢子等。但直接镜检的检出率很低，从而导至漏诊。正常人痰液内可有真菌定植，故痰液涂片只有找到致病性真菌才可以确定诊断，找到条件致病性真菌不应轻易诊断为真菌感染，还应结合临床其他方面综合考虑，因此直接镜检法对深部真菌病诊断作用有限。培养法灵敏度低，且周期长，不能为临床提供早期诊断的依据。组织病理学检查因危重患者很难承受侵袭性的取材方法（如肺组织活检），也给临床应用带来一定困难。

　　二、血清学诊断

　　（一）真菌特异性抗原检测

　　1.（1,3）-b-D葡聚糖测定（G试验）：（1,3）-b-D葡聚糖（BG）广泛存在于真菌细胞壁，细菌、病毒、人体细胞及其他病原菌无此成分，故作为真菌抗原有较高的特异性。当真菌侵入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞吞噬、消化，BG可从胞壁中释放，使得血液或其他体液中BG含量增高，故通过检测BG的含量能够及时反映真菌感染情况。最近的一项荟萃分析显示，G试验在诊断血液病、重症非血液疾病患者、移植受者真菌感染的灵敏度和特异度分别为76.8%和85.3%。但是G试验在血液透析、免疫球蛋白、白蛋白治疗以及其他包含葡聚糖的药物治疗患者中可见假阳性结果，且此抗原与阿莫西林、革兰阳性的微生物细胞壁组分有交叉反应，因此G试验检测的结果应结合临床症状进行解释。

　　另外，BG虽然存在于绝大多数真菌的细胞壁中，但仍有部分真菌感染如隐球菌属和结核菌属无法通过G试验检测诊断，因为隐球菌具有厚壁包膜，因此，对于这两大类真菌感染的检测不能完全依靠G试验，还须依赖其他实验室手段（如隐球菌抗原检测或真菌培养等），以进一步确诊。

　　2.半乳甘露聚糖测定（GM试验）：GM试验主要适用于侵袭性曲霉病的早期诊断。GM是曲霉特异性抗原，存在于曲霉细胞壁上，在菌丝生长时被释放到周围组织中，GM释放量与菌量呈正比，可以反映感染程度，连续检测GM可用于监测疗效，在造血干细胞移植患者中的诊断灵敏度高。GM试验在曲霉感染的诊断参考价值已得到国内外的认同。Sarrafzadeh等通过对确诊、拟诊、疑似侵袭性肺曲霉免疫缺陷3组患者的血清GM检测，发现GM值在确诊患者中升高，高于其他2组；以折点≥1.5为阳性，其灵敏度和特异度分别为69.2%和72.2%，指出GM检测对早期诊断免疫功能减退患者的侵袭性肺曲霉病有意义。

　　值得注意的是，以下情况可出现假阳性：（1）使用半合成青霉素尤其是哌拉西林一他唑巴坦；（2）新生儿和儿童；（3）血液透析；（4）自身免疫性肝炎等。而在以下情况可出现假阴性：（1）释放人血循环中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除；（2）以前使用过抗真菌药物；（3）病情不严重；（4）非粒细胞缺乏的患者；（5）使用肠内营养。

　　3.隐球菌乳胶凝集试验：该试验是以乳胶颗粒为载体，将新型隐球菌抗体球蛋白标记在其表面，制成致敏乳胶悬液，用于检测患者脑脊液或血清标本中的新型隐球菌荚膜多糖抗原，可产生肉眼可见的凝集反应，是一种简便、快速、特异的实验诊断方法，目前在国内外得到广泛应用，在国外，该方法常规用于新型隐球菌感染的诊断。有国外学者报道，其灵敏度和特异度达83%和100%。

　　该试验在以下情况可出现假阳性：如类风湿因子阳性，标本中含有琼脂凝固剂、羟乙基淀粉，HIV感染者的非特异性凝集等，而感染早期或菌株荚膜太少所致荚膜抗原浓度太低、血清含有免疫复合物干扰以及荚膜抗原浓度过高导至前带现象等则可出现假阴性。

　　（二）特异抗体检测 检测真菌抗体的方法临床很少应用，主要原因在于此方法检测免疫低下患者的真菌抗体，灵敏度和特异度均不高，且常见假阴性。检测定植但未感染时也可能出现假阳性结果。念珠菌属是正常人体的定植菌。念珠菌属的多种抗原组分（如释放的产物、细胞壁组分、膜以及细胞质组分等）均可产生念珠菌抗体。因此检测到念珠菌抗体并不能确定是侵袭性念珠菌感染还是正常定植。曲霉抗体检测也有争议，对于中性粒细胞减少患者，血液中循环抗曲霉抗体水平与侵袭性曲霉病相关性不大。但也有研究显示肺移植患者血清中特异的IgG抗体水平增高与烟曲霉感染的影像学、细胞学和微生物学证据一致，且早于它们出现。

　　三、分子生物学诊断

　　（一）聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：PCR是一种特异扩增DNA的体外酶促反应，常用PCR技术有普通PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR等，目前倾向于应用实时PCR技术，因其闭管操作可减少扩增后手工处理、扩增产物污染的可能，还能用于定量检测，有助于预后分析、临床疗效评估等。

　　一项大型荟萃分析总结了2000至2008年PCR检测血液标本（全血、血清、血浆）曲霉DNA的16项临床研究，共检测1 618例患者的10 000份以上临床标本，结果提示PCR方法有较好的灵敏度和特异度，但到各项研究的具体结果差异较大，其中最为突出的现象是单次PCR结果特异度明显低于连续2次PCR，而灵敏度相差不大，故认为可将单次PCR检测用作高危患者侵袭性真菌感染的筛查，阴性者可用作排除诊断，而连续2次PCR检测的阳性预测值高，可用于临床诊断。但需指出的是，当真菌感染率低于10%时，即使检测方法有很高的灵敏度和特异度，其阳性预测值也很难超过40%，阴性预测值则不受影响。Badiee等收集了38例怀疑脑膜炎患者的152份脑脊液及血清标本（墨汁染色阴性），其中10例患者的脑脊液实时PCR检测阳性：3例白念珠菌，1例光滑念珠菌，4例曲霉，2例白念珠菌合并曲霉，从而提示PCR对非隐球菌脑膜炎亦有诊断意义。

　　（二）分子杂交 通过将标记的核酸作为探针，与待测标本核酸进行杂交反应，阳性结果提示标本中存在相应的核酸。在临床真菌检验中，待测核酸序可以为真菌基因组DNA和细胞总RNA，将核酸从细胞中分离纯化后或者经PCR获得的基因片段可以在体外与探针杂交（膜上印迹杂交），也可以直接在细胞内进行（细胞原位杂交）。DNA微阵列技术（又名DNA芯片、基因芯片）是分子杂交基础上的一项生物高新技术，它用免疫荧光标记的待测样品与有规律的固定在芯片片基上的大量探针按碱基配对原则进行杂交，能进行大批量基因检测，从而提高诊断效率。

　　有学者报道通过原位杂交法可在2.5 h内鉴定出血培养阳性的白念珠菌和光滑念珠菌菌种，从而大大缩短诊断时间。Yoo等设计了细菌、真菌特异探针，采用盲法检测1 12份血液样本，以培养结果作为金标准，约10 h内有104份样本被正确检出，灵敏度达93%。Spiess等将PCR法与基因芯片法联合用于真菌检测，结果显示联合应用有利于提高诊断率。

　　（三）DNA指纹分析（DNA fingerprinting） ：DNA指纹分析是一种在单一试验中可检测出大量DNA序列差异或DNA多态性的分子生物学技术，根据真菌DNA的特性，采用不同的处理方法，形成特征性谱型，可用于菌种鉴定及分子流行病学调查。

　　1.随机扩增多态性（RAPD）分析：应用随机合成的寡核苷酸（8-12 bp，多为10 bp）作为引物，通过PCR扩增模板DNA，采用低退火温度使引物与模板DNA在可能有1或2个碱基错配的情况下结合而形成扩增产物。扩增循环次数要求较多，一般为35-45个循环，特征性带型的出现取决于引物和模板的DNA序列，依照带型可以进行菌种鉴定及分型。RAPD方法不需要抽提大量的DNA模板，可直接检测临床标本，并可同时进行种间鉴定和种内分型。Baires-Varguez等通过研究92株念珠菌临床分离株发现RAPD引物OPEl8在念珠菌菌株鉴定上有较高的灵敏度和特异度。

　　2.限制性片段长度多态性（RFLP）分析：RFLP分析是利用限制性内切酶在特定的核苷酸序列上对双链DNA进行酶切，然后进行凝胶电泳，依据片段大小不同将其分为不同谱型。由于不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，从而产生的DNA片段长度呈现多态现象。这种方法特异度及敏感度均较高，但相对来说，需提取大量完整的DNA，操作较为烦琐。Shokohi等采用单链构象多态性分析技术（single-strand conformation polymorphism，SSCP）对扩增自80株念珠菌临床分离株和3株标准株的DNA片段进行分析，能够获得菌种鉴定。Isik等采用该法能够鉴别念珠菌与曲霉。

　　3.SSCP分析：指将PCR扩增的DNA片段变性，成为单链DNA，在一定的条件下，单链DNA的空间构象与分子内的碱基组成密切相关，一个碱基的差异即可形成不同的构象，不同构象的DNA在脉冲场凝胶电泳（PAGE）中的泳动速率不同，形成的带型也不同，故能反映单链DNA片段的多态性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将单链DNA分离，形成不同谱型。该技术对于判定致病株与非致病株、耐药株与非耐药株，以及相近属种的鉴定等均具有一定的意义。

　　（四）DNA序列分析（DNA sequencing） DNA序列分析对于了解真菌的基因结构、表达及分子进化关系等具有十分重要的意义，Henry等就利用ITS区对曲霉标准株、临床株和其他属菌株进行研究，先用PCR扩增该区，然后测序，进行DNA序列分析，结果与GenBank的非标准株进行比对，把曲霉属真菌与其他属菌株分离出来，如念珠菌属、

　　隐球菌属真菌等，并把曲霉属鉴定到种水平，如黄曲霉、烟曲霉、土曲霉等。但此技术对DNA的量和纯度要求较高、仪器设备价格昂贵，操作技术要求高，限制了其在医学真菌中的常规应用。

　　深部真菌病的发病率逐年上升，早期快速、准确的诊断方法以及成功地应用于临床，对高危患者有重要意义。直接镜检方法快速但阳性率低，无菌部位标本培养及组织病理学检查为确诊依据，但此类检测方法周期长且为有创操作。真菌血清学检查及分子生物学检测方法具有方便、快速等优势，具有较好的应用前景，但由于各种因素造成假阳性、假阴性，其应用价值也受到了一定的限制。