taqman探针的荧光基团和淬灭基团的问题

huangchj03 · 发表于 2015-1-6 12:49

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关于taqman探针的荧光基团和淬灭基团，我一直有以下疑问：
1、为什么荧光基团标记在5端，淬灭基团标记在3端，能不能反过来？
2、能不能两个集团标记的近一点，比如，荧光基团标记在5端，淬灭基团标记在中间dTNP上？
期待高手指点。

huangchj03 · 发表于 2015-1-21 10:23

   目前这个问题挂了好久了，还没人回答我，期待关注，期待高人指点迷津，有时候不弄清楚这些问题，心里不踏实。
   针对于第一个问题，我还是没有看到更好的文献支持，我还没看到Taqman realtime-PCR最初的专利，希望有人能提供，应该在专利中有解答，目前还是存在疑问，自己没有尝试过这样做，所以还是有疑问；
   第二个问题，现在有一点点儿明朗了，看到一些将淬灭基团标记在探针中间位置的dTTP上设计，也看到过一些商家提供这样的标记选择，我想应该是没有问题，但是还有一点疑问就是，如果真的没有问题的话，那为什么主流的选择是标记在3端，难道仅仅是为了阻止探针扩增吗？所以还是期待高人进一步指点。

huangchj03 · 发表于 2015-1-23 09:20

这两个问题很显然不是我们日常考虑到的问题，但是一定是方法建立时发明人考虑的问题，因此我特意的查询了相关专利和文献，也确实找到了一些蛛丝马迹，因此自问自答一次，希望给有同样疑惑的同仁们一些解答吧。
第一个问题：我的理解是这样的，两个基团互换，原则上应该没有大的影响，但是我们采用的Taq酶是利用5-3外切酶，我们常见的思维是优先标记5端，这样优先被切割掉，有利于荧光信号的释放，早期的研发专利荧光基团和淬灭基团都标记在5端或近5端，如果查看专利US7205105等MGB相关专利的话，发现一度出现淬灭基团是标记在5端，荧光基团是标记在3端的探针。所以对于这个问题，不需要再深究了，就好比通往目的地有两条平行的路，我们选择了走其中一条，然后我们问为什么不走另一条路是一样的问题。
第二个问题：这个问题可以参考两篇文献：《Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization》、《Design and Synthesis of Fluorescence Energy Transfer Dye-Labeled Primers and Their Application for DNA Sequencing and Analysis》，在第一篇文献中，作者研究了淬灭基团在不同位置对结果的影响，研究发现，标记在3端末端信号与标记在中间7-27等位置几乎没有显著差异，作者认为没有差异的原因是单链探针的结构的柔韧性（flexibility），所以双标记探针标记在两个顶端最好方案，第二篇文献，作者研究了淬灭基团分别标记在距荧光基团1、2、3、4、10碱基的位置，研究发现距离10个碱基位置效果最佳。目前供应商也提供标记在中间的服务，价格较贵一点点儿，工艺上也困难一点，因此普遍采用的是目前的做法。