CLIA/CAP 二代测序临床检测标准操作指南

本临床二代测序操作指南来自于Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988/College of American Pathologists (CAP) laboratory。

相较于Sanger测序，二代测序技术（新一代测序技术，NGS）拥有高通量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。过去的数年间，相当数量的NGS服务商迅速成长，而美国病理学家协会却没有及时依照美国临床实验室改进修正法规（CLIA）编制指南来规范这个检测。

基于NGS平台的临床检测是一种新的检测方式，相较于原有检测方法，其复杂程度大大提高，因此迫切需要一个规范标准来指导各实验室进行检测。

CAP于2011年成立了NGS工作部门，商讨NGS临床检测实验检查表的内容。本次CAP列出共计18条实验室要求的检查表，包含检测的二代测序实验过程和生物信息学分析过程。

二代测序技术（NGS）包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生物信息分析部分（dry bench）。实验操作部分包括以下部分或所有的流程：病例样本的采集处理、核酸提取、片段化、生物分子标签（barcode）、目标区段/基因捕获富集、连接、扩增、文库构建、上机测序、数据产出。生物信息分析部分主要依赖于高性能的计算机和不同的生物信息分析方法，主要流程包括：参考序列比对、组装、变异检测、注释、临床解释（依赖于是否运用诊断工具）。

CAP依据NGS实验操作部分和生物信息分析部分分别建立了独立执行标准和检测事项：实验操作部分检测条目包括标准操作流程文件的建立、流程验证、质量管理体系、数据可靠性验证、异常情况记录及维护更新；生物信息分析部分检测条目包括：变异结果描述、附带结果的报道、数据储存、版本可追溯性及数据传输安全性。

实验操作部分

实验操作标准操作流程文件

NGS实验室需要建立一个标准操作流程文件用来指导产生NGS实验数据

对于临床实验室来说，一个详细的NGS实验标准操作流程文件是实验室质量评估的一个重要指标。标准操作流程文件中需要包括DNA/RNA样本准备、片段化、建库、样本分子标签（barcode）、样品混合、上机测序相关的所有标准操作流程指导。在此基础上，所有独立的实验步骤和后续的操作才能够一一被追溯。

标准操作流程文件需要包括NGS实验过程中所有相关的方法、试剂、仪器、软件、软件版本等，此外，还应对质控标准进行详细描述，包括详细的质控参数、接受域和否定域。

例如目标区段捕获测序实验，需要描述捕获区段的基因组信息（包括目标区域基因组位置、所包括的基因等）、捕获富集的具体方法及流程、包含不同类型临床样本（血液、FFPE）处理方法的SOP等。

NGS实验操作流程验证

实验室必须对实验操作流程进行验证，并且当流程有修订的时候，必须要对整个实验操作过程进行重新确认，以检验修订后的流程是否能够符合要求。重新验证的程度和范围视修订的程度和范围而定。

所有实验室自己研发的分子诊断或临床检测项目，在进行临床应用前必须对NGS每个操作流程的性能表现进行一个内部的验证。NGS实验是一个复杂的工作流程，它由很多独立步骤组合而成。每步流程都需要分别优化到一个最佳经验值，以此来综合决定最佳的实验操作条件及各参数的设置。

在内部验证中需要考虑的必要因素包括：实验的敏感性和特异性、准确性、精确性以及检测能力的上限和下限（动态范围）。对于任何一个分子实验，对于不同的样本类型（血液、唾液、组织等）都需要独立的进行一个验证。

考虑到NGS技术并不能够完全的检测到所有理论上的变异情况，因此我们需要结合“其它检测方法（Sanger、芯片）”和“特定分析物（positive controls）”的手段来验证NGS实验的检验性能。

必须要考虑的一些性能参数：

1、分析灵敏度：可参考一个金标准的方法来观测NGS技术能检测出的最多的变异位点的数目。需要注意的是，在验证分析灵敏度“基准线”的时候，要尽可能的考虑全基因组上不同的区域。此外，也需要对基因组上不同的变异类型分别进行独立的检测（SNP、CNV、SV、homopolymers）。验证过程中，阳参也是必需的。可以选择一些包括相关变异（例如p.F508del in CFTR）的病例样本作为阳参进行验证。

2、注意一个统计方法所涉及的假阳性和假阴性问题。考虑到不同方法对特殊样本（肿瘤样本，ctDNA，嵌合体）检测局限性，有时sanger测序并不是所有变异检测的金标准。所以在这种情况下，可通过稀释样本混合实验（dilution of samples with known allele frequencies）来测试NGS技术检验变异能力的动态范围。另外，数据的精确性可通过生物学重复（至少三个样本）和技术重复（相同样本不同barcode）来评估。

3、注意同源序列的干扰，如果实验对象有这样的情况存在，需提前进行同源序列比对分析。实验室必须提供一个方法来确认检测出的变异已排除了假基因同源序列的干扰，并且呈现此方法准确合理的证明文件。

4、如果样本通过标签（barcode）进行混样，必须证明每个样本在实验操作过程中保持样本各自的特异性。

NGS实验操作流程——质量管理体系

实验室必须遵循质量管理体系来进行NGS实验操作

CAP认证的实验室必须建立一个质量管理体系，实验室规模、临床市场、专业知识以及实验室主管在质量保证程序中的决策权共同决定了质量管理体系的内容。质量管理体系必须是文字记录的，且与设计文件内容相符一致。对于一个进行NGS实验的实验室来说，一个高质量的质量管理体系应包含以下属性：

1、 质量管理体系有明确的技术路线（工作流程），包括有评估实验前期的操作步骤、测序过程、实验后期分析工作的报告。

2、NGS质量管理体系需要纳入到所在机构总的质量体系中。如果实验室只是医院或医疗中心的一部分，其NGS质量管理体系必须适从整个机构的质量保证程序内容。

3、管理体系中应当标注在实验过程中存在的常见问题。标明这些问题对结果的影响或对临床应用的影响以及是否违背实验室的一些政策和相关程序。体系文件中需要包含每次矫正的记录、效果以及操作准则和流程的修订内容。

4、质量管理体系的宗旨是保证所进行的检测是临床目的相关的。尤其对于NGS，在没有其它检测能力相当的检验方法存在的情况下，这个宗旨尤为重要。检验分析的合理适当性必须以医学科学为基准。

5、管理体系应当鼓励实验人员对整个检测程序内容提出意见与建议，员工的意见与建议调查必须包括在质量保证系统里。

NGS结果验证

实验室需要一个相关政策方案用来进行NGS检测变异结果的验证

考虑NGS技术的不断发展，人们也意识到基于NGS实验所涉及的假阳性和假阴性的问题。CAP根据不同实验室的性能评价灵活的决定该实验室什么时候进行结果验证实验、实验怎样进行以及是否推荐利用NGS以外的技术在其它家系成员中进行结果验证。

每个进行NGS实验的实验室必须有个政策，明确指示验证实验需要进行，或者有个证明文件说明相关的验证为何不需要。

CAP给予实验室足够的灵活性去选择适当的结果验证的方法（并不完全依赖于Sanger，可以是碱基特异性的聚合酶链反应，溶解曲线分析）。

实验记录

在实验过程记录中，处理样本的方法、仪器、试剂必须是可识别且可追溯的

在临床NGS实验过程中，一个全面完整的实验记录是必需的，包括整个实验过程中的实验条件、步骤、计算软件等。相应的，完整的存档记录必须明确表明整个实验过程中每个临床样本的试剂、引物、测序化学反应、平台都是可追踪的。此外，记录中还应包括对检测的目标区段的描述（基因组、外显子、特定基因、特定panel、转录本或甲基化区段），分析中引用的细节（文献，网站）。

建议实验室最好建立一个文档记录系统，详细的记录上述细节，并可随时调档查阅。

特殊案例记录

实验室需要建立一个特殊案例记录文档，用来记录偏离NGS标准实验操作流程的特殊病例样本情况

当检测对象及操作过程偏离实验SOP时，实验室需要对此案例进行记录，并做详细的解释说明。偏离的情况比如收到一例非常规样本后改变实验操作流程、文库构建及上机测序步骤。

当接受一个样本时，就需要对样本是否满足实验要求作出判断。如果存在犹豫及疑问，需要在工作记录中标注出，并及时与导师或实验室主任进行交流讨论。同时，需要与样本收集人沟通此问题，并将交流讨论的内容记录在工作文档中或做电子文档记录。特殊案例记录需要包括跟问题样本相关的所有方面，包括发现的问题、解决方案、相关的交流（涉及的人员，通知人与被通知人，时间）。相关记录必须列入每月质量控制报告中。

有时，实验室的SOP也需要进行更改，促使实验操作步骤更加细致明确，并剔除一些偏差误差。这种情况下，所提议的修改的内容需要实验室导师或其它与实验技术直接相关的技术人员在内的2位以上成员同意，并且修改的内容必须是经过实验室主任签字认可的。

更新维护

实验室必须具有相关政策用来对NGS实验过程中相关仪器、化学溶剂、试剂的升级更新进行监测、更新实施和记录

为防止实验使用过时的、被淘汰的方法，实验室需要及时升级更新。因此，NGS实验室必须出具相关政策方案，用来定期检测和更新在实验过程中的仪器、化学溶剂、试剂。NGS实验中所用到的最新的文库构建、扩增、测序的方法是被实验室所验证过的，能够有效的提升数据质量的重复性和实验的准确性的。此外，方案中还需注明检测升级更新的方法，更新的实施时间（每次更新的间隔时间）以及在临床实际应用前的进一步验证方案。

生物信息分析部分

NGS数据相关生物信息分析可分成三个主要步骤：首先是产生记录碱基序列信息、碱基质量的FASTQ格式文件。FASTQ文件中，每4行显示一条read信息，包括碱基类型、标识符及碱基质量信息，FASTQ类型文件也是目前NGS领域中应用最广泛的信息储存类型；第二步是将检测获得的序列与参考基因组进行序列比对，以此检测病人序列与参考基因组序列之间的差异，之后将这些差异与基因、蛋白功能关联，进行注释；最后一步是将检测出的变异与病例表型信息相关联，筛选结果（标注与疾病相关的稀有变异；基于家系做筛选）并形成临床报告。

结合NGS的临床诊断需要依赖于各种生物信息计算方法及软件，临床实验室在针对不同诊断应用时需要能够合理有效的选择相应的数据计算方法及生物信息分析软件。同时，对于这些算法和软件，实验室需要利用大量的样本来验证所用算法、软件在分析不同变异类型时的灵敏度、特异度以及重复性，以此来确认所用的生物信息学分析工具及参数是否符合标准，符合实验室要求及临床报告标准。

一旦方法工具确认后，实验室也需要对运用于临床诊断的生物信息分析各步骤进行记录描述，并对这些步骤实施一个质量管理方案。

NGS生物信息分析标准操作流程文件

实验室需要准备一份标准操作流程文件用来规范NGS生物信息分析中的数据分析、描述、及结果报告流程。

实验室必须详细记录描述分析过程、结果报告中涉及到的所有算法、软件、数据库信息。分析流程中的这些软件、算法、数据库的版本必须是可查询且可追溯的。实验室必须明确详细的记录与默认参数不一致的自定义参数设置。在序列比对中，所用到的参考基因组序列版本号及组装的细节也需要详细记录在文件中。

SOP文件中需要详细的描述NGS数据的整个生物信息分析流程，包括输入文件、输出文件及每步分析内容，并且描述每步过程中的质控条件及参数（每条read的质控、碱基质量、测序深度、覆盖度）。在后期数据筛选的流程及依据也需要体现在SOP文件中。

NGS生物信息分析流程验证

实验室必须对数据分析流程进行验证，并且当流程有修订的时候，必须要对整个分析过程进行重新验证，以检验修订后的流程其性能是否能够符合要求。重新验证的程度和范围依赖于修订的程度及范围。

与NGS实验操作流程一致，实验室也需要利用一些包含已知变异的序列样本来验证整个数据分析流程的精确性、特异性、重复性。验证的样本数量依据不同平台决定，验证样本的选择可参考一些权威的样本数据，比如HapMap样本、已知遗传变异的细胞系或是之前分析过的临床诊断样本。注意一些高同源性序列的分析问题，如果需要分析这种类型的样本数据，实验室需要重新开发一个独立的测试方法。

       虽然NGS并不严格的要求确定变异分析中的假阳性率和假阴性率，但实验室需要针对不同变异类型，选取一些经典的样本数据来评估分析中假阳性和假阴性概率。假阳性可以通过利用不同种分析方法评估出来，而假阴性的评估则会更加的复杂一些，假阴性可能由很多不同的因素产生，包括目标区段reads覆盖度不够、碱基检出的阈值设置太严苛、链特异性造成reads分布不均匀而未达到质控条件等。分析中加入一些目标区域外的对照区域，可能是一个很好的对照措施。

       在NGS实验建库过程中加入样本标签（barcode）是目前比较常做的事。但实验室需要确认标签序列在混池中的特异性，并且确认在分析的过程中，能够准确的识别区分出标签序列。在分析混池样本测序数据时，设置一个保留或过滤标签序列的标准是必需的。例如在分析过程中，只保留标签序列与建库时所添加的标签序列完全一致的reads。因此，可以通过检测标签序列是否完整来判断在混池过程中样本之间是否污染。

       整个分析流程也需要对肿瘤样本体细胞变异的检测灵敏度动态范围进行评估。这可通过对目标变异进行等浓度稀释的手段来进行评估。

       当整个分析流程有改动时，对流程的再次验证也是必需的。一个实用的再次验证方法则是利用前期已验证过的数据，在设置新参数后，重新分析来检测分析的性能。

       NGS数据分析流程的验证及再验证的有效性依赖于完整的验证及再验证记录及临床应用的批准文件。

NGS生物信息分析流程——质量管理体系

实验室必须遵循质量管理体系来进行NGS生物信息分析

临床实验室必需依据对应的质控标准来监测NGS数据常规分析工作，在分析过程中，任何与质控标准有偏离的地方都需要进行检查并制定对应的解决方案。偏差的情况如符合质控要求的reads数目太少；检测出的变异数目明显偏离预期；样本标签（barcode）序列被污染，导至检出的reads数显著增多。这些偏差都指示着实验过程中的误差或分析中的失误。因此，一个合适的质量管理体系必须包括一个清晰的流程用以调查记录这些偏差，寻找原因，并建立合适的修正策略，以及调查原因的方法步骤和实施的修正方案。

生物信息分析流程——更新

实验室需要有相关政策用以监测、记录及实施整个生物信息分析流程中相关软件算法的补丁修补、更新工作

NGS生物信息分析中通常会运用多种有附加脚本和数据库的开放源代码软件包。考虑到这个领域不断的在更新进步，实验室必须有相关政策方案用以监测、记录及实施整个生物信息分析流程中相关软件包、数据库的补丁修补、更新工作，方案中还应该体现更新频率（更新频率即体现更新的间隔时间），并进行详细记录。

数据存储

实验室需要在生物信息分析过程中对原始数据、中间数据及最后的结果数据的存储工作准备相应的方案

NGS数据整个分析中会产生大量的数据文件，包括原始的芯片扫描文件，序列信息碱基质量的FASTQ文件，分析流程中产生的中间数据文件及进行变异检出的VCF文件。本检查表并不要求所有的文件都要长期存储保留，实验室有决定权来决定在最后结果报告出来后什么类型的数据文件需要储存，以及储存的时间。NGS Work Group建议存储FASTQ文件或者是整理过的BAM/SAM文件，以便后期需要时对数据进行重新分析。需要注意的是，实验室在制定数据存储的方案时，需要符合当地政府对数据存储的政策要求。

版本可追溯性

每份病例数据分析报告中，生物信息数据分析流程所涉及软件、算法、数据库的版本都是可追溯的

NGS生物信息分析流程中通常会涉及多种开放源代码软件包、脚本及数据库。每个软件或脚本的性能会直接显著的影响整个生物信息分析的效果。因此，对于每一份病例报告，实验室需要能够准确追溯其数据分析流程。对于自己开发的软件或脚本，如果有任何修改，实验室需要对其修改做好记录，但此记录不必体现在病例结果报告中。非常推荐实验室为每一套分析流程编制一个特定的、唯一的版本名称（如：NGS数据分析流程v1.0.1）。如果整套分析流程中有软件包、脚本或数据库发生变动，或者是软件的配置参数发生变化，相应的版本号就需要重新编辑设定，并且整个流程需要平台重新验证。

异常记录

实验室需要建立一个异常记录文档，用来记录偏离NGS生物信息分析标准分析流程的具体情况

整个分析流程中，如果有任何偏离数据标准分析流程的地方都需要被详细的记录下来，包括软件程序包、脚本、版本号、数据库、命令行或参数的任何变动。分析流程中出现的一些漏洞或纰漏也需要详细的记录在异常记录文档中，包括问题的描述、问题发生原因的调查、修正措施、相关的交流及直接负责人的批示。异常记录文档需要与相关的病例分析报告对应起来，而实验室主管也需要将这些与临床NGS数据分析SOP差异的地方与对应的临床医师进行交流。相关记录列入每月质量控制报告中。

当分析一些特殊病例或基因组区间的时候，相对于SOP而言，整个分析流程中所涉及到的任何修改变动，对应的解释说明都需要体现在最终的结果报告中。

NGS数据传输保密性政策

实验室需要制定相关的规章制度用以确认病人测序数据在内部及外部存储及传递过程中的安全性和机密性

临床NGS实验中，除了会产生大量的特定基因/区域的序列数据外，还会包括很多病人的个人信息（性别、出生年月、医疗记录、健康状态等），实验室必须建立一个严格的规章流程来确保这些个人信息的安全及隐秘，包括这些信息在不同实验室与第三方公司之间传递的安全性。

政策中需要体现的内容比如：数据的加密、数据传输的安全性、对访问用户进行权限设置、访问记录及内容统计。实验室需要遵循Health Insurance Portability and Accountability 法规（健康保险可移植性及责任与义务法规），例如与外部的供应商签订商业合同，阐明其充分的权责用以确保临床样本基因组数据在传递和接受时的机密性。

序列变异——结果解释及报告

实验平台对测序分析变异结果的描述及报告需要遵循专业组织的建议与指导

基于NGS技术，实验室可以进行各项不同的检测，小到单个基因检测，大到基因panel、外显子组或整个基因组。通过NGS技术，我们通常会检测到大量的之前未报道过的新变异位点或致病位点。

目前，大多实验室在进行变异结果报道描述时会遵循人类基因组变异协会命名指南(www.hgvs.org; accessed January 6, 2014)和美国医学遗传学学院（ACMG）的遗传疾病变异分类指导。推荐在参考这些指导时，利用他们在网站发布的最新版本。ACMG的变异分类指导手册目前正在修订，新的版本里将会包括变异的解释指南。在整理遗传疾病相关变异时，推荐参考ACMG的遗传疾病变异分类指导。而其它临床基因组检测（肿瘤、病原体诊断），实验平台需要依据自己专业的判断来对变异进行分类或当相应的指导文件出现时，遵循其分类原则。

注意变异位点对应的转录本ID，一些变异位点会作用于特定的转录本，影响该转录本的翻译及功能。因此在进行如此变异位点描述时，需要指明这些位点影响的具体转录本ID。为避免结果的混淆，在撰写临床结果报告时，需要详细列出每个变异位点对应的转录本登录号和版本号及对应的蛋白质编号。

对于遗传疾病，常见的变异分类可分为5大类：1）致病的；2）可能致病的；3）临床意义未明；4）可能良性的；5）良性。而对于其他肿瘤或病原体诊断中，目前还没有一个标准的可参考的分类指导文件，以往的结果描述中，所用到的专业术语也是各式各样，大致的描述形式为标明序列变化的结果，包括致病的、有毒的、疾病相关的，并加上一些修饰描述，如可能的、临床意义未明或未确认（possible, probably, and likely, or VUS and VOUS）。

在描述序列变异造成的临床影响时，实验平台需要充分考虑到疾病发生原因，不同人群发病率、外显率及功能学实验。推荐充分利用一些公共数据库（Exome Variant Server，1000G）与自己的数据做一些关联比较。对于一些大型的外显子组或基因组测试来说，评估一个基因对疾病的影响程度，了解不同变异类型对疾病的贡献度及这些变异的遗传模式是非常关键和重要的。

推荐参考的数据库如下表：

额外的遗传结果报告

实验室需要制定相关政策方案用来报道在检测过程中出现的与临床症状关联不大的额外的遗传发现

在分析单个基因、panel、外显子组或基因组中，会发现一些与检测表型无关的具有重要临床意义的遗传结果。这种现象同样也会出现在对某种特定疾病进行特定分析的情况中（目标区域捕获、特定的生物信息分析）。因此，在利用NGS技术进行临床检测时，实验室需要意识到这种额外的具有临床意义的结果出现，并需要制定相关的方案来决定这些额外的结果是否或什么时候应该被报告。最近发布的ACMG关于报道医学上可行的偶然发现结果建议书中列出了一个最少量的基因列表，指明如果一个已知的变异位点被发现，这个结果就应当被报告。实验室也需要根据自身的权益制定对额外结果报告的方案政策，如果一个实验室决定不报道这些发现或只报道一小部分变异结果，那这些决定政策需要在实验平台结果报告中进行声明。

实验平台需要基于道德伦理之上去决定是否告之病人某些确定的遗传信息。透露这些额外结果的风险等级取决于疾病的严重程度、临床可干预性和其它一些风险-利益指标（例如二型糖尿病，心血管疾病相对于癌症、孟德尔遗传疾病而言，风险等级较低）。

实施大规模临床样本NGS检测的实验室需要意识到一些医学和伦理知识学习的重要性，在整理NGS数据报告和制定结果报告方案时要充分考虑这些因素。

NGS检测转接（外包）政策

实验室需要制定相关政策用以选择NGS检测转接（外包）的实验室或其它服务商。转接（外包）的内容可以包括整个NGS检测步骤，也可以是单纯的实验操作部分或数据分析部分

NGS临床检测相对于传统实验室检测模式而言更具复杂性和挑战性，因此越来越多的实验室开始将检测的部分工作外包到一些其他实验室或服务商。随着这种外包趋势越来越明显，NGS Work Group在NGS checklist 2014版本中增加了对检测外包政策的要求。检查表强调实验室主任或负责人对外包实验室或服务商的选择具有直接的责任。因此也希望实验室主任或负责人能够保证这些承接NGS临床实验操作和数据分析外包公司/机构的质量及性能。一些特别需要注意的地方包括：1）实验或分析的周期是能够符合临床检测要求的；2）承接NGS实验操作的实验室是被CLIA所认证的或其实验室能达到CAP要求的每一项标准；3）承接NGS数据分析工作的公司/机构所提供的结果其准确性及质量是得到验证的。承接实验操作部分的实验室需要出具CLIA认证证明复印文件；承接生物信息分析工作的机构需要出具其内部验证证明的复印文件。

备注

随着利用NGS技术进行临床诊断的实验室越来越多，CAP认识到采用NGS技术的临床实验室需要对其NGS技术进行一个资格认证。这篇文档主要展示了CAP NGS工作部门对临床NGS检测资格认证的内容及要求，并清晰的表达了CAP NGS工作部门在制定相关要求时的出发点和视角，力求在制定资格认证要求时能够保证病人个人信息安全和指导临床实验室合理的使用NGS技术。考虑到科技的快速发展和NGS技术的不断变化，此文档中只制定了用于NGS临床检测认证的常规要求及管理标准。实验室依据自身情况拥有一定的灵活性和自主权进行变通，以满足这些常规的要求。文档中涉及的一些专业术语、结果解释及附带结果报道的要求主要适用于利用NGS技术进行遗传疾病的检测。对于其他一些特殊样本（肿瘤、FFPE样本）的NGS检测分析要求，会增加一些其它相关的认证要求，而NGS工作部分认为现在制定这些特殊要求还未达到成熟的阶段。

NGS工作部门声明文档中的这些认证要求随着NGS临床检测的不断发展和成熟也会不断的进行修订。随着认证方案的实施，CAP NGS工作部门会接收到不同实验室的问题反馈，此外，NGS部门也意识到，目前的这些认证要求并不能覆盖所有利用NGS技术进行的临床应用。因此，NGS部门会定期的进行讨论用以改进和明确化这些认证要求。信息反馈及平台经验会融合到部门当前和今后的商议中，关于NGS技术相关的认证要求也会不断的被修改和更新。