蛋白容易形成聚体的原因及解决方法

蛋白聚集是生物研究与产业应用中的常见挑战，它会导至蛋白失活、稳定性下降，严重影响实验结果。这一现象通常源于蛋白内在的疏水区域、游离巯基，以及外部环境如浓度、pH、温度等因素的共同作用。为解决该问题，需从优化缓冲液组成、改进操作流程及分子设计等多维度入手，系统性地寻找维持蛋白单体稳定性的最佳条件。以下小编将针对以上内容做一个详细的介绍。

一、蛋白形成聚体的主要原因

蛋白聚体的本质是蛋白分子之间发生了非共价或共价的异常相互作用，导至从二聚体、寡聚体到不溶性沉淀的多种形式存在。主要原因可分为以下几类：

1. 蛋白质的内在因素（由序列和结构决定）

暴露的疏水区域：蛋白质在天然状态下，疏水氨基酸通常包埋在分子内部。当蛋白部分去折叠、发生突变或本身设计上就有大块疏水区域暴露时，这些区域会像“油滴在水里”一样，相互聚集以避开亲水环境。

游离的半胱氨酸（Cysteine）：半胱氨酸的巯基（-SH）非常活泼，容易与另一个巯基发生氧化，形成错误的二硫键，将不同的蛋白分子共价交联在一起。

不稳定的结构域或构象：某些蛋白天然就处于一种“临界稳定”状态，容易发生构象波动，为分子间相互作用提供了机会。

固有的聚集倾向序列：某些特定的氨基酸序列（如富含β-片层的序列）本身就有很强的倾向形成淀粉样纤维或聚集体。

2. 外部环境因素（实验操作条件）

浓度过高：这是最常见的原因之一。蛋白浓度越高，分子间碰撞的概率越大，形成聚集体的可能性也越大。这类似于拥挤的房间里人们更容易挤在一起。

pH值不当：溶液的pH值决定了蛋白表面氨基酸残基所带的电荷。当pH值接近蛋白的等电点时，蛋白分子净电荷为零，分子间的静电排斥力最小，更容易聚集。

离子强度不当：

低离子强度：无法屏蔽电荷，可能导至某些特定的静电相互作用。

高离子强度：“盐析”效应，盐离子会与水分子结合，剥夺蛋白的水化层，使蛋白疏水区域暴露并聚集。

温度应激：

高温：会增加分子动能，破坏蛋白的弱相互作用力（氢键、范德华力等），导至蛋白去折叠和聚集。

反复冻融：冰晶的形成和融化会产生巨大的机械应力、局部浓度和pH值变化，极易导至蛋白变性和聚集。

机械应力：剧烈震荡、涡旋、搅拌会产生气-液界面，蛋白在界面上容易发生去折叠和聚集。同样，通过细小的针头反复抽吸也会产生剪切应力。

金属离子：某些金属离子（如Cu²⁺, Fe³⁺）可能催化氧化反应，导至二硫键错误形成或氨基酸残基（如甲硫氨酸、色氨酸）氧化，从而引发聚集。

添加剂缺失：缺乏必要的稳定剂、保护剂或防腐剂。

二、防止和解决蛋白聚集的方法

解决策略的核心是：创造一个让蛋白单体处于能量最低、最稳定状态的环境。

1. 优化溶液环境（缓冲液）

这是最直接、最常用的方法。

调整pH值：通过预实验或查阅文献，找到远离蛋白等电点（pI）的pH条件，使蛋白表面带有充足的同种电荷，利用静电排斥力防止聚集。常用缓冲液如Tris, HEPES, Phosphate等。

优化盐浓度：添加适量的盐（如NaCl）可以屏蔽电荷，但要避免过高浓度导至“盐析”。通常需要做一个简单的盐浓度梯度实验来寻找最佳点。

添加还原剂：如果聚集是由二硫键错误连接引起的，必须添加还原剂。

温和型：二硫苏糖醇（DTT） 或 β-巯基乙醇。注意它们不稳定，需要新鲜添加。

稳定型：三(2-羧乙基)膦（TCEP），更稳定、不易被氧化，且作用不受pH影响，是目前的首选。

添加去垢剂：对于膜蛋白或疏水性很强的蛋白，低浓度的去垢剂（如Triton X-100, Tween-20, CHAPS）可以屏蔽暴露的疏水区域，是防止聚集的利器。

添加稳定剂和保护剂：

糖和多元醇：甘油（5-20%）、海藻糖、蔗糖。它们通过“优先排阻”效应，稳定蛋白的天然构象。

氨基酸：L-精氨酸、L-谷氨酸等是常用的助溶剂和聚集抑制剂。

载体蛋白：添加牛血清白蛋白（BSA） 可以吸附在容器表面，减少目标蛋白的损失和剪切应激，并竞争性地抑制聚集。

添加螯合剂：如EDTA 或 EGTA，可以螯合溶液中的金属离子，防止金属催化的氧化反应。

2. 改进实验操作流程

降低蛋白浓度：在满足实验需求的前提下，使用尽可能低的浓度。对于储存，可以浓缩后分装，使用时再稀释。

避免物理应激：

轻柔混匀：使用移液器缓慢吹打或置于摇床上混匀，避免涡旋和剧烈震荡。

避免反复冻融：将纯化后的蛋白分装成小份，在-80°C或液氮中快速冷冻。使用时在冰上或4°C冰箱中缓慢解冻单一份。

考虑储存温度：对于短期（几天到几周），在4°C储存并添加防腐剂（如NaN₃）可能比反复冻融更好。

使用惰性材料：使用低蛋白吸附的离心管和移液器吸头（如聚丙烯材质）。

3. 蛋白纯化与处理策略

温和的纯化条件：在整个纯化过程中（如裂解、层析）都使用含有稳定剂（如甘油、还原剂）的缓冲液。

去除已有的聚集体：

超速离心：在高速（如>10,000g）下离心5-15分钟，可以去除大多数不溶性聚集体。

过滤：使用0.22μm滤膜过滤，可以去除颗粒状聚集体并同时除菌。

尺寸排阻色谱（SEC）：这是分离蛋白单体和聚集体最有效的方法，既可以分析聚集情况，也可以用于制备高纯度的单体。

重新折叠：如果蛋白是在包涵体中表达，复性过程本身就是防止聚集的关键。需要缓慢地去除变性剂（如尿素、盐酸胍），并在复性缓冲液中添加所有上述可能的稳定剂，让蛋白有足够时间正确折叠。

4. 分子生物学手段

如果以上方法都无效，问题可能出在蛋白本身。

构建融合标签：在蛋白的N端或C端融合一个高度可溶的标签，如GST、MBP、SUMO等。这些标签不仅能增加溶解度，还便于纯化。之后可以用特异性蛋白酶（如TEV、PreScission）切除标签。

点突变：通过定点突变将暴露的疏水氨基酸替换为亲水氨基酸，或将游离的半胱氨酸突变掉（如变为丝氨酸Ser）。

截短表达：如果蛋白的某个结构域是导至聚集的“元凶”，可以尝试只表达那个稳定的结构域。

小编总结：

当遇到蛋白聚集问题时，可以遵循以下排查流程：

1. 快速诊断：通过SDS-PAGE（非还原和还原）、动态光散射（DLS）或SEC分析聚集体的性质和大小。

2. 优化缓冲液（首选）：

从标准缓冲液（如20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 8.0）开始。

系统地添加 5-10% 甘油 和 1-5mM TCEP。

如果问题依旧，尝试调整pH和盐浓度。

对于疏水蛋白，加入 0.01-0.1% 的Tween-20。

3. 改进操作：立即分装，避免冻融和剧烈操作。

4. 去除聚集体：在使用前进行高速离心或过滤。

5. 终极手段：如果聚集严重且无法解决，考虑更换表达系统、使用融合标签或进行点突变。

总的来说，蛋白聚集是一个多因素问题，通常需要结合多种方法才能找到最佳解决方案。耐心和系统性的筛选是关键。