PHOTON：一种实现亚细胞水平空间转录组学的新方法

PHOTON方法主要分为四个步骤（如下图A）：

（1）原位‌构建photocaged cDNA文库‌：定制的反转录（RT）引物，5'端通过光切割linker连接荧光团，并引入四个6-N-POM修饰的dT以及一个生物素偶联的dT。

（2）激光选择性释放cDNA分子‌：使用405nm激光选择性地照射ROI，使荧光团从RT引物上切割，同时恢复N-POM dT的碱基配对功能。

（3）‌样品消化和PCR手柄连接‌：细胞裂解后纯化核酸，并将PCR手柄连接到RT引物的5'端。这一连接步骤仅发生在经过光切割的5 '磷酸基团并且N-POM dTs也被释放的cDNA上。

（4）‌文库制备和测序‌：成功连接的cDNA通过生物素被富集，通过PCR扩增，并使用Illumina Nextera XT测序文库制备流程进行文库制备。最终产物在Illumina平台上进行测序。

为了验证PHOTON方法的可行性，研究团队首先在培养的HeLa细胞中进行了测试。结果显示，当使用405nm激光照射细胞时，荧光强度显著下降了86.9%（图C），表明cDNA分子成功被光切割。进一步的分析显示，PHOTON库是从细胞RNA中生成的，且photocage机制在防止不需要的光切割方面非常有效（效率达99.1%）（图D）。此外，研究还评估了PHOTON的信号噪声比（SNR），发现即使在低激光功率下，即使只有0.5%的细胞被光切割，PHOTON的信号仍然高于噪声（信噪比> 1.2）。考虑到灵敏度、产率和PHOTON的特异性，作者最终选择了2.5 mW的激光功率和100µs的停留时间进行所有后续的亚细胞PHOTON实验。

为了验证PHOTON在组织水平捕获细胞转录组的能力，研究团队选择了小鼠卵巢中的颗粒细胞（GCs）作为目标。通过PHOTON方法进行了约600个GCs的光切割，并生成了PHOTON库。结果显示，已知的GC标志物如Inha、Nr5a2和Serpine2在PHOTON数据集中高表达，而卵巢中其他细胞类型的标志物则没有高表达（图B）。与公开GC RNA-seq数据集进行比较，结果显示，PHOTON捕获的基因数量显著多于公开数据集，且PHOTON数据与Slide-seqV2数据之间的高度相关性进一步证明了其准确性。综上所述，这些数据表明，PHOTON可以以空间分辨的方式准确捕获组织内靶细胞类型的转录组信息。

研究团队还验证了PHOTON在亚细胞水平捕获RNA信息的能力。研究团队开发了一个流程可自动识别和光切割HeLa核仁中的cDNA分子（图A）。通过PHOTON方法，成功识别了核仁中富集的RNA种类，包括非编码RNA的rRNAs和小核仁RNA（snoRNAs）。此外，PHOTON还发现了与核仁相关的长链非编码RNA RMRP（图B），与之前的发现一致。接下来，研究团队将PHOTON应用于线粒体。通过使用MitoTracker可视化线粒体，PHOTON流程成功捕获了线粒体中cDNA分子，并发现许多线粒体基因在线粒体中显著富集。

研究团队将PHOTON应用于应激颗粒（SGs），一种无膜的细胞质mRNA-蛋白质组装体。通过PHOTON方法，研究团队成功捕获了SGs中的RNA内容，并与公开数据集进行了比较。结果显示，PHOTON数据与公开数据集之间存在显著重叠，但也发现了一些差异，这可能是由于传统SG纯化方法的特异性较低所致。总之，这些结果表明PHOTON可以准确地测定亚细胞区室的RNA含量。

研究团队以SGs为模型，探讨了mRNA翻译效率、转录长度以及m6A修饰在mRNA招募到SGs中的作用。通过PHOTON方法，他们发现被SGs富集的转录本往往具有较低的翻译效率，且转录本长度与SGs富集程度之间存在正相关关系（图A）。此外，作者还发现m6A修饰在mRNA招募到SGs中起重要作用，尤其是在长转录本中。通过抑制METTL3（一种m6A甲基转移酶），研究团队发现m6A修饰的减少显著降低了mRNA在SGs中的长度依赖性的富集（图D）。总之，这些结果表明转录物长度和SG富集之间的相关性至少部分是由m6A修饰介导的。

作者提出了PHOTON，一种结合高分辨率成像和高通量测序的方法，以实现亚细胞分辨率的空间转录组分析。作者证明了PHOTON是一种多功能工具，可以准确地在组织水平上原位捕获目标细胞类型的转录组，如卵巢中的颗粒细胞，以及亚细胞区室（如核仁、线粒体和应激颗粒）内的RNA含量。利用PHOTON，作者还揭示了m6A修饰在mRNA招募到应激颗粒中的功能作用。这些结果共同表明，PHOTON有潜力揭示不同尺度上空间和转录组信息之间的联系。

未来，随着技术的不断进步和方法的持续优化，PHOTON有望在更广泛的生物学和医学研究领域发挥重要作用。例如，它可以用于研究不同疾病状态下细胞转录组的空间变化，为疾病的诊断和治疗提供新的靶点和策略。同时，结合其他高通量技术，如单细胞测序和表观基因组测序，PHOTON将进一步推动我们对生命科学的深入理解。