CRISPR-Cas系统是一类由RNA引导的核酸酶，能够针对特定的核酸序列进行切割，自其发现以来，在分子生物学领域引起了革命性的变化。Cas9是最为人熟知的一种，它通过切割与crRNA（CRISPR RNA）互补的目标DNA序列附近特定位置来实现基因编辑。与Cas9不同，Cas12和Cas13在切割目标序列后仍保持活性，并能非特异性地切割附近的单链DNA或RNA。可以利用这种反式切割活性，通过添加核酸报告分子进行核酸生物传感，从而实现信号的放大。因其可编程性、简便性和高灵敏度，在即时分子检测（POCT）中展现出巨大的潜力。然而，关于Cas12系统对单核苷酸多态性（SNP）检测灵敏度的报道差异较大，且缺乏潜在的机制解释，限制了Cas12的应用。 近日，杂志Communications biology上发表了一篇题为“Profiling crRNA architectures for enhanced Cas12 biosensing”的文章。本文旨在通过优化crRNA架构来提升Cas12生物传感的性能。研究结果表明，与目标DNA的20个碱基对互补的crRNA对于快速和敏感的检测是最佳的，而互补长度为15个碱基对的crRNA对于SNP检测是最优的。此外，作者还发现SNP敏感性基于核苷酸位置呈现周期性变化，以及通过设计多价crRNA，研究人员进一步提升了Cas12生物传感的性能，展示了多价CRISPR生物传感器在即时分子检测中的巨大潜力。 图片来源：Communications biology 主要内容 饱和cas12与靶标DNA结合的条件 Cas12的反式切割活性依赖于三价复合物的形成：Cas12与crRNA组装，核糖核蛋白复合物与靶DNA结合，从而激活反式切割（图a）。为了准确测量动力学参数，Cas12与激活剂DNA的结合必须达到饱和状态。在保持crRNA和靶DNA浓度分别为12.5 nM和1 nM的情况下，作者尝试crRNA-20和crRNA-40时，反式切割活性分别在~20 nM和~100 nM Cas12处达到饱和（图b、d）。
饱和cas12与靶标DNA结合的条件。 图片来源：Communications biology crRNA长度与检测速度及灵敏度的关系 为了研究crRNA长度对Cas12生物传感的影响，研究人员系统地改变了crRNA的长度，并测量了不同长度crRNA下Cas12的反应速度和灵敏度。实验结果表明，crRNA长度必须与DNA互补长于15个核苷酸才能诱导快速反式切割活性。crRNA-20导至最快的反应速度，crRNA越长，反而导至反式切割活性降低（图c，d）。 进一步的研究发现，crRNA长度对Cas12反应速度的影响主要体现在最大反应速度（Vmax）上，而米氏常数（Km）的变化相对较小。较短的crRNA（如crRNA-15）虽然能够饱和DNA结合，但无法诱导足够的构象变化来激活显著的反式切割活性。相反，较长的crRNA（如crRNA-40）则由于离子排斥作用增加和报告底物结合减弱，导至反式切割活性降低。因此，crRNA-20在反应速度和灵敏度之间达到了最佳的平衡。
crRNA长度与检测速度及灵敏度的关系。 图片来源：Communications biology crRNA长度与SNP检测灵敏度的关系 研究人员研究了不同长度crRNA下Cas12对SNP突变的敏感性，结果表明，与目标DNA互补15个碱基对的crRNA-15在稳健的SNP检测中表现更佳，其中M1到M15的活性显著降低，低于WT的10%。作者还发现SNP敏感性基于核苷酸位置呈现周期性变化，大约每6-7个核苷酸重复一次。这一周期性规律与DNA-RNA双螺旋结构有关。通过分析LbCas12a与crRNA和激活剂dsDNA的晶体结构，研究人员发现对SNP突变最敏感的核苷酸位置与Cas12蛋白的相互作用最为紧密，且这些位置位于双螺旋的两侧。这一发现为解释先前报道中Cas12对SNP敏感性差异提供了结构基础，并表明不同Cas12亚型由于结构差异可能表现出不同的SNP敏感性。
crRNA长度与SNP检测灵敏度的关系。 图片来源：Communications biology 二价crRNA在提升生物传感性能中的应用 为了进一步研究crRNA架构对Cas12生物传感性能的影响，研究人员设计了异二价crRNA，分别在5’至3’ 方向上包含Cas12a crRNA和Cas9 sgRNA 。实验结果显示，异源二价crRNA在dCas9存在的情况下，能够显著降低背景活性，并通过协同结合表现出增强的反式切割活性。具体来说，在dCas9存在的情况下，目标DNA的存在使信号增强了~65倍（图c）。这种增强作用依赖于连接子（linker）长度，最佳linker长度约为5个核糖核苷酸，这一长度能够跨越目标DNA中两个结合位点之间的20个碱基对距离。 多价CRISPR生物传感器提供了独特的可编程性，因为结合模块（dCas9）与生物传感模块（Cas12）是解耦的。这种设计使得研究人员能够通过调整结合模块和传感模块的组合来优化生物传感器的性能，为生物传感器的设计提供了新的思路。
Cas12与二价crRNA的活性。 图片来源：Communications biology 总结与讨论 本文通过系统地研究crRNA架构对Cas12生物传感性能的影响，发现crRNA-20在反应速度和灵敏度之间达到了最佳平衡，而较短的crRNA则更适用于SNP检测。此外，研究还揭示了SNP敏感性的周期性规律，并为解释先前报道中Cas12对SNP敏感性差异提供了结构基础。通过设计多价crRNA，研究人员进一步提升了Cas12生物传感的性能，展示了多价CRISPR生物传感器在即时分子检测中的巨大潜力。 未来的研究将进一步探索多价CRISPR生物传感器的通用性，并开发能够预测Cas12反式切割动力学的理论模型。此外，随着CRISPR技术的不断发展，研究人员有望设计出更加高效、灵敏和特异的生物传感器，以应对新兴威胁和挑战。这些努力将为临床诊断、疾病监测和公共卫生应对提供强大的工具和支持。 |
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