基于纳米孔的ELISA，检出限低至0.03fg/ml，同时检测6种标志物

近日，杂志Nature Nanotechnology上发表了一篇题为“Nanopore-based enzyme-linked immunosorbent assay for cancer biomarker detection”的文章。在这项工作中，作者将纳米孔传感技术与酶联免疫吸附试验相结合，开发了一种基于纳米孔的酶联免疫吸附试验（NELISA）。NELISA实现了高效的检测性能，具有高定量精度、低LOD和高特异性。使用不同的肽探针，还能在一个纳米孔内同时检测多个生物标志物。该方法的检出限低至0.03 fg ml^-1，可同时检测血液样本中的6种生物标志物。总体而言，基于纳米孔的ELISA具有高灵敏度和多重检测能力，适用于下一代诊断和即时检测应用。

图片来源：Nature nanotechnology

通过简单的血液离心获得含有抗原的血清样品，将血清样品添加到有捕获抗体的孔板中，并与随后加入的酶标记检测抗体形成三明治结构。洗涤后，将肽探针引入孔中与酶相互作用。最后，收集样品溶液进行纳米孔易位实验。NELISA最关键的是使用了肽探针，它含有与检测抗体相关的酶的催化位点，可以通过纳米孔进行易位，从而在酶消化前后产生特征信号。

夹心NELISA抗原检测示意图

图片来源：Nature nanotechnology

作者选择了三种常用的酶：碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶，分别与CA19-9、CEA和AFP的检测抗体连接，并设计并合成了含有这些酶裂解位点的肽探针。NELISA对CA19-9、CEA和AFP的定量结果显示（图b、d、f），这三种生物标志物的线性检测范围超过6个数量级。LOD达到相当低的水平，CA19-9为5.0 mU ml-1， CEA为100 fg ml-1， AFP为20 pg ml-1。且只有匹配的抗原才会产生电流信号频率的变化，表明对生物标志物的检测具有很高的选择性。

为了在单个样品中同时检测不同的生物标志物，需要能够区分9种肽探针的易位信号的电流轨迹。为了识别这些信号，作者尝试开发一种机器学习算法，结果显示，支持向量机（SVM）能够高精度区分这9种肽探针，准确率几乎为100%。

NELISA对CA19-9、CEA和AFP的定量

图片来源：Nature nanotechnology

为了验证NELISA是否可以用于检测抗体生物标志物，作者开发了一种检测乙型肝炎病毒核心抗体（抗HBc）的竞争性测定方法。抗HBc样品与HRP偶联抗HBc一起加入到包被抗原的孔板中。孵育并洗板后，加入底物H2O2孵育60分钟。再加入肽探针与剩余的H2O2发生反应，并进行纳米孔测量。结果显示，检测范围跨越7个数量级，LOD达到3.2 fg ml-1，是报道过的最低值之一（图c）。

竞争性NELISA抗体检测示意图

图片来源：Nature nanotechnology

作者收集了54名健康参与者和57名癌症患者的血液样本，将使用NELISA对血液样本中CA19-9， CEA和AFP进行同步定量。结果显示，所有三种生物标志物的纳米孔测量值与临床检测值密切匹配（图e-g），两种方法的检测结果具有较高的一致性。此外，使用NELISA和化学发光免疫分析法比较了三种生物标志物的LOD测量值（图h-j）。结果表明，NELISA获得的LOD比化学发光免疫分析法低2 - 4个数量级。

临床样品中生物标志物的同步检测

图片来源：Nature nanotechnology

在这项研究中，作者建立了一种基于纳米孔的检测癌症生物标志物的ELISA。该方法的检出限低至0.03 fg ml^-1，可同时检测血液样本中的6种生物标志物，包括抗原和抗体生物标志物。总体而言，基于纳米孔的ELISA具有高灵敏度和多重检测能力，适用于下一代诊断和即时检测应用。

与化学发光免疫分析法相比，NELISA采用电信号作为输出方式，有效解决了光信号之间的信号串扰问题。此外，NELISA还有其他几个明显的优势。首先，由于肽探针的稳定性、可重复性和低电流信号干扰，纳米孔测量允许对所有已知生物标志物进行足够低LOD值的生物标志物的精确定量。其次，能够同时检测多达六种生物标志物，具有精确的定量和极低的检测限。第三，纳米孔装置高度便携，适合在资源有限的地区进行现场测试。总的来说，NELISA可以检测临床血液样本中的各种癌症生物标志物，并有可能作为许多不同疾病的诊断工具。再加上自动化技术，在这项工作中开发的NELISA有望成为下一代诊断工具和护理点测试的强大竞争对手。