结核病（TB） 是一种由结核分枝杆菌（Mtb）引起的传染病，至今仍是全球公共卫生的重大威胁。2023年，估计有1080万人感染结核病，同年，共有125万人死于该病。药物耐药性结核病（DR-TB）的蔓延更是加剧了这一局势，尤其是耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）的出现，使得治疗变得更加复杂和昂贵。因此，快速、准确地检测结核分枝杆菌的药物敏感性对于指导临床治疗、防止耐药性的传播至关重要。 目前，结核分枝杆菌的药物敏感性检测主要分为基因型检测（gDST）和表型检测（pDST）两种方法。gDST在实验应用中得出结果的时间从1到10个工作日不等，且可能无法检测到所有耐药机制。pDST表型检测通过观察细菌在含药培养基中的生长情况来判断其耐药性，被认为是金标准，但耗时较长，通常需要两周以上。 近日，杂志Nature communications上发表了一篇题为“Phenotypic drug susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG in 12 hours”的文章。在这项研究中，作者提出了一种快速pDST方法，结合微流体、单细胞成像和基于深度神经网络（DNN）的图像分析，可以在3 h内可靠地分离出耐药和敏感耻垢分枝杆菌菌株。这种pDST方法旨在帮助降低诊断性TAT，实现更快的DST，可以支持更有效的药物反应监测，使患者受益。
图片来源：Nature communications 主要内容 01 基于微流控芯片的 快速表型药敏试验（pDST）原理 基于微流控芯片的快速表型药敏试验（pDST）工作流程如下图所示。液体培养中的细胞被装入微流体装置，在微室中进行分隔。微流控芯片有两排微室作为细胞陷阱；每排有100个尺寸为50 × 60 × 1µm的微室。一旦细胞被装入微室，就会被相差显微镜连续动态观测，监测不同抗生素暴露条件下微室中细胞的生长情况（图c）。得到的图像数据用基于深度神经网络（DNN）的方法进行分析。
快速pDST工作流程的示意图 图片来源：Nature communications 02 结核和非结核病原体的快速pDST 作者使用牛分枝杆菌卡介苗和耻垢分枝杆菌作为结核和非结核病原体的代表，在微流控芯片内观察其总细胞面积扩张，这种总面积扩张是由于细胞在微室内的生长。未经治疗的对照组（左）和异烟肼治疗组（右）的牛分枝杆菌卡介苗总面积随时间的变化有显著差异（图d），治疗组归一化后的生长速率显著偏低（图f）。同样，耻垢分枝杆菌对照组菌群（左）的生长速率与药物处理组菌群（右）相比，也显著升高（图i）。
两种分枝杆菌快速pDST的结果 图片来源：Nature communications 03 快速检测药物治疗反应 作者使用快速pDST测定牛分枝杆菌卡介苗和耻垢分枝杆菌在利福平（RIF）、异烟肼（INH）、乙胺丁醇（EMB）或者利奈唑胺（LZD）存在条件下的生长速度。对于倍增时间为18-24小时的牛分枝杆菌，可以在3小时内检测到药物处理组和对照组之间的生长速率差异（图a-d）。对于快速生长的耻垢分枝杆菌，在1小时内可以检测到两个群体之间的生长速率差异（图e-l）。
快速检测药物治疗反应 图片来源：Nature communications 04 耐药菌株的检测 作者对RIF、INH和LZD耐药耻垢分枝杆菌菌株进行了pDST，并将耐药菌株的pDST谱与敏感亲本菌株进行比较。耻垢芽孢杆菌RIF E1 ~ E3的pDST结果显示，RIF E1和E2菌株对RIF高度耐药；RIF E3抗性相对较弱（图c）。对于INH耐药菌株，INH E1表现出高耐药性（图d）；INH E2和INH E3在加药后的前30min内生长速率下降，3h后逐渐恢复到参考水平（图e， f）。3株LZD耐药菌株均显示对LZD抗性较高（图i）。总体而言，利用快速pDST法可以在3 h内可靠地分离出耐药和敏感耻垢分枝杆菌菌株。
耐药菌株的检测 图片来源：Nature communications 总结与讨论 作者发现，基于生长的pDST可以在12小时内对缓慢生长的分枝杆菌进行快速鉴定。作者使用牛分枝杆菌卡介苗和耻垢分枝杆菌作为分枝杆菌病原体模型，并将它们暴露于利福平（RIF）、异烟肼（INH）、乙胺丁醇（EMB）、利奈唑胺（LZD），采用相差显微镜对微流控芯片中的细菌生长进行了连续动态观测。一种基于深度神经网络的分割算法被用来量化生长速度，并确定菌株对药物治疗的反应。总体而言，利用快速pDST法可以在3 h内可靠地分离出耐药和敏感耻垢分枝杆菌菌株。这种pDST方法旨在帮助降低诊断性TAT，实现更快的DST，并可能支持更有效的药物反应监测，这将使患者受益。此外，短试验TAT最大限度地减少了药敏试验期间产生的获得性耐药性。 该方法不仅显著缩短了检测时间，提高了检测效率，还有助于减少因长时间检测而导至的获得性耐药风险。然而，要将其应用于临床还需解决一系列问题，如优化样品制备流程、提高检测灵敏度、降低成本等。此外，对于高度毒力和耐药的结核分枝杆菌的临床样本检测也需进一步验证。 |
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