重新定义分子诊断：快速、稳定的qPCR、LAMP和NGS解决方案

尿液样本：本研究使用的尿液样本来自于5位随机性别的个人、提供的未经过滤的尿液样本的混合样本。

检测过程：使用Meridian的尿液专用Lyo-Ready可冻干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX153），与引物和探针一起冻干。检测是直接使用尿液样本对冻干的预混液复融，进行直接RT-qPCR检测，反应条件为50°C，10分钟；95°C，2分钟；95°C，10秒+65°C，30秒， 45个循环。在相同反应中，采用了竞品试剂作为对比参照（使用供应商推荐的浓度进行测试）。

检测结果：

血液样本：K2-EDTA人类全血 和人类血浆。

检测过程： 使用Meridian的血液专用Lyo-Ready可冻干血液直扩RT-LAMP预混液（MDX125）与引物一起混合后冻干。直接使用血液或血浆样本复融冻干物，进行直接检测。LAMP反应为65°C，60分钟。在相同反应中，使用了两种竞品试剂进行对比。所有反应都使用SYTO™82荧光染料对扩增产物进行检测。

检测结果：

NGS文库制备：使用Covaris LE220超声波破碎仪将100 ng纯化的基因组DNA切割为300bp，使用Meridian 冻干NGS文库制备试剂盒（MDX219）进行末端修复、加A尾、连接Illumina适配子，并进行PCR扩增（4个循环）。在每个必需步骤中，使用Beckman Coulter的AMPure XP磁珠清理处理过的片段。文库通过Meridian qPCR文库定量试剂盒（MDX039）进行定量，其片段大小分布通过Bioanalyzer评估。

NGS测序：文库稀释至12 pM，加载到MiSeq Reagent Kit v2（500循环）试剂盒的芯片中。测序以2 × 250 bp的配置进行。读取数据通过BWA-MEM2映射到E. coli K12 MG1655参考基因组，并使用bcftools进行分析。数据分析内容包括碱基识别、样本条带分离、读取数量、映射效率、GC偏差、重复率及序列碱基成分。最后，对液态和冻干形式NGS建库试剂盒生成的文库数据进行了对比分析。

检测结果：

将以上建库文库进行测序，结果显示，液体和冻干试剂建立的文库在读取数、比对率、GC偏向性、文库多样性以及重复率等方面表现相似。具体而言，修剪前的读取数表明比对效率良好。两个文库表现出均一的GC含量、相近的重复率和预期的序列碱基组成。总体而言，冻干形式的NGS建库试剂制备的文库在性能数据与与液体建库试剂制备的文库性能表现一致，同时具备简化物流和存储的潜力。

本研究旨在展示先进的分子诊断原料如何支持更多的检测研发人员实现更快的商业化和更可持续的分子诊断检测产品。

• 预优化的qPCR/LAMP扩增化学体系加速了新型MDx检测方法的开发时间。这些专用原料试剂不仅能显著缩短检测开发的优化步骤，还因其稳健性和可靠性更有助于完成通过检测验证环节。

• 冻干及兼容冻干的试剂在试剂检测性能上具有和液体相同的性能。本研究证明了，在多个技术平台（如qPCR、LAMP或NGS）中，试剂在常温下储存时仍能保持市场领先水平的性能。通过加速新检测方法的开发并实现常温储运的操作，所展示的技术无疑将推动MDx在全球范围，特别是在发达国家之外的普及。