化学发光标记物：吖啶酯

1. 简介

吖啶酯是一类含有吖啶环结构的化合物，已被证明是非常有优势的化学发光标记物，外观通常为黄色粉末，具有良好的化学稳定性。因具有分析速度快、设备简单、灵敏度高及线性范围宽等优点，已经广泛应用于生物医药、环境监测及药物分析等领域。吖啶酯之所以在生物标记领域具有广泛的应用基础，主要得益于其结构中包含的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）活性酯基团。这一基团具有高度的反应性，能够轻易地与多肽、蛋白和抗体等生物分子中的伯氨基（即-NH₂基团）发生偶联反应。在这一反应过程中，NHS活性酯基团与伯氨基通过化学键合，形成稳定的酰胺键（即-CONH-键）。这种酰胺键的形成不仅增强了标记物与生物分子之间的结合稳定性，还确保了标记过程的准确性和可靠性。吖啶酯的这一特性使它成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的重要工具。

2. 吖啶酯分类

吖啶酯是吖啶盐的一个总称，它包含多个不同的系列，每个系列都有其特定的用途和特性。以下是常见的几种吖啶酯及其分类：

吖啶酯（DMAE-NHS）：这种吖啶酯在化学发光及免疫分析、受体分析及多肽检测等研究中有着广泛的应用。由于其结构上引入了一个疏水性的苯环，增强了空间位阻，增强了抗水解性，提高了稳定性，但是同时也增强了吖啶酯的疏水性。

吖啶酯（Me-DMAE-NHS）：为DMAE-NHS的类似物，Me-DMAE-NHS也可用于蛋白、抗原和抗体等的标记，三氟甲基（CF3）是一种重要的含氟基团，将该官能团引入分子中常常会显著改变母体化合物的脂溶性，增强分子的代谢稳定性，因此Me-DMAE-NHS具有高度的灵敏度和稳定性。

吖啶酯（NSP-DMAE-NHS）：NSP-DMAE-NHS在DMAE-NHS中引入了N-磺丙基，使化合物的水溶性和解离度增加。在酸性溶液中(pH<4.8)都很稳定。

吖啶酯（NSP-SA-NHS）：其化学结构中引入了磺酰胺基团，并且具有较大的空间位阻，这有助于增强其水解稳定性。

吖啶酯（DMAE-NHS）和吖啶酯（Me-DMAE-NHS）标记目标蛋白后不会改变目标蛋白的带电状态，但是可能会改变目标蛋白的亲疏水性。吖啶酯（NSP-DMAE-NHS）和吖啶酯（NSP-SA-NHS）标记目标蛋白后会额外引入负电荷改变目标蛋白的带电状态，并且可能会改变目标蛋白的亲疏水性，因此吖啶酯标记目标蛋白后需要评估标记物的稳定性、聚集状态和活性。

3. 吖啶酯标记蛋白原理

如上图，在中性或碱性条件下，吖啶酯中NHS作为离去基团被取代，蛋白质的伯氨基与吖啶酯形成稳定的酰胺键。反应完成后，多余的吖啶酯通过透析、脱盐柱或超滤除去。

4. 吖啶酯发光原理

在碱性H2O2溶液中，当过氧化氢离子对分子进行进攻时，会生成一种不稳定的二氧乙烷。这种二氧乙烷随后会分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮。当N-甲基吖啶酮从激发态回到基态时，会释放出最大发射波长为470nm的光子。该发光系统具有显著优点：它无需复杂的催化过程，也不需要额外的增强剂，这不仅降低了背景发光，还提高了信噪比，减少了干扰作用。此外，其光释放过程快速且集中，发光效率高，发光强度大。

5. 标记方法（仅供参考）

5.1. 溶液配制

（1）标记缓冲液：0.2M NaHCO3 (pH=9.0)或20mM PBS；

（2）终止缓冲液：10%赖氨酸 0.2M NaHCO3 (pH=9.0)溶液；

（3）脱盐纯化缓冲液：0.1M PBS (pH=7.4)；

（4）吖啶酯发光液：(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2。

5.2. 标记步骤

（1）溶解与混合：将适量的吖啶酯溶于无水DMSO或DMF中，配制成特定浓度的溶液（2.5mg/mL）。然后，取特定量的待标记生物分子（如抗原、抗体或蛋白等）与标记缓冲液混合，并加入适量的吖啶酯。（标记比例1:10~1:50，具体需根据氨基酸组成进行摸索调整）

（2）反应：将混合液在室温下避光反应一段时间（通常为1小时左右），使吖啶酯与生物分子充分偶联。反应过程中，需定期涡旋混匀以确保反应均匀。

（3）终止与纯化：反应结束后，加入终止缓冲液以终止未反应的吖啶酯，减少非特异性结合。随后，通过透析、脱盐柱或超滤等方法纯化标记产物，除去未反应的吖啶酯及其他杂质。

5.3. 吖啶酯标记效率检测

检测吖啶酯标记效率主要依赖于其化学发光特性。这一过程通过测量标记后的生物分子在碱性过氧化氢溶液中所展现的发光强度来实现，该强度能够间接地反映出标记效率的高低。为了计算标记效率并确定最佳的标记条件，通常的做法是比较在不同标记条件下（例如，不同浓度或不同反应时间）所得到的发光强度数据。这些比较结果有助于识别出理想的标记条件，从而更为准确地评估标记效率。

6. 注意事项

在准备使用吖啶酯时，有几个关键步骤需要注意：

首先，从库存中取出吖啶酯之前，要根据其保存状态提前一段时间取出。由于吖啶酯是冰冻保存的，立即开盖可能会导至温差引起的水蒸气凝结，使粉末粘连，不便于后续的称量工作。

其次，吖啶酯作为一种化学发光试剂，对光线非常敏感。因此，在保存时需要冷冻并避光存放。同样地，在运输过程中，尤其是在天气炎热或进行长途运输时，也需要确保吖啶酯处于冰冻并避光的状态，以避免其性能受到影响。

最后，在使用吖啶酯时，可以直接使用溶解吖啶酯的容器进行去皮称量，然后加入无水DMSO或DMF进行溶解。这样做可以避免在称量或转移过程中产生损耗，从而确保使用的吖啶酯量准确无误。