邻近连接实验表征CTC的HER2- HER3二聚化

在临床中，抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）取得了突破，该抗体可抑制配体非依赖性HER2/HER3信号传导并触发免疫原性反应，使用这种靶向治疗与HER2阳性乳腺癌患者临床结局的显著改善相关，包括预期寿命的大幅延长和复发率的降低。

然而，最近对肿瘤组织中HER2-HER3二聚化水平的评估显示了其作为预测生物标志物的潜力。特别是，使用FRET-FLIM （Förster共振能量转移-荧光寿命成像显微镜）确定FFPE肿瘤组织的HER2- her3二聚化状态已被证明可预测术后10年内转移复发的可能性，而不依赖于肿瘤HER2表达。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells， CTC）已被证明是不同类型癌症的预后因素，尤其是乳腺癌。CTC是血液中从原发或继发肿瘤部位释放的恶性细胞，有可能扩散到远处器官并导至转移。目前尚未对CTCs的HER2-HER3二聚化状态进行评估。检测CTCs中HER2-HER3二聚化状态可能是帕妥珠单抗疗效的潜在无创预测指标。

在本文中，作者重点关注一种被称为HER2阳性乳腺癌亚型，这种癌症与癌细胞的质膜上HER2蛋白的扩增有关。与靶向HER2蛋白的治疗相结合，HER2- HER3二聚化阻断，进一步改善了患者的结局。在这项工作中，作者提出了一种新的方法，通过芯片结合原位邻近连接试验来表征CTC，从而可以在单个CTC水平上量化HER2-HER3二聚化事件^[2]。

PLA是一种依赖于抗体和寡核苷酸结合特异性的免疫染色变体。在一个典型的PLA实验中，两种抗体被用来识别两种感兴趣的蛋白质。每个抗体与一段彼此互补的短序列寡核苷酸偶联，标记为PLUS和MINUS探针。当这些探针的接近距离小于40nm时，添加两个与探针杂交的连接寡核苷酸将导至在连接酶存在的情况下形成一个闭合环状模板。随后添加聚合酶和荧光标记的寡核苷酸，然后导至闭合环状模板(D)的滚环扩增，可以可视化为一个可以通过表观荧光或共聚焦显微镜检测和定量的独特荧光点。由于只测量滚环模板的荧光信号，PLA具有良好的信噪比和较高的空间精度和灵敏度 ^[1] 。

为了评估单个CTC的HER2-HER3二聚化状态，作者使用了PLA技术。有两种类型的PLA：直接和间接。在直接PLA中PLA探针偶联于一抗，而在间接PLA中偶联于二抗。PLA最广泛使用的方法是上述间接PLA，其中使用与寡核苷酸探针偶联的二抗。

首先用EpCAM阳性的癌细胞系优化PLA条件，这些癌细胞系可以模拟CTC的上皮表型，接种在玻璃玻片上。特别地，作者首先优化了细胞通透性时间和抗体浓度。作者使用了已知HER2高表达和低表达的细胞系：HER2扩增的SKBR-3（评分3+）和HER2-低表达的MDA-MB-231（评分0 ~ 1+）。

分析过程的另一个重要方面是将PLA与若干标记物的免疫染色相结合，这些标记物用于确定每个捕获细胞的肿瘤状态。CTC的定义为上皮有核细胞（DAPI+，细胞角蛋白或CK+） C45染色阴性（CD45−）；由于免疫染色，它们可以与CTC分析中经常发现的污染内皮细胞区别，而这是由于捕获过程的选择性不完善^[3]。作者发现免疫染色不能在PLA之前进行，因为信号会受到PLA条件的影响，特别是加热步骤。然而，作者能够进行HER2-HER3 PLA，然后进行免疫染色。在这些条件下，作者可以成功检测到HER2-HER3二聚化事件的数量和CTC标志物：DAPI+ CK+ CD45（下图e）。

Ephesia系统依赖于免疫磁性富集，即通过抗EpCAM抗体的磁珠形成的自组装磁柱阵列捕获细胞。芯片的顶部包括4个捕获室，总长度为3.3 cm，宽度为3 mm，具有优化的金刚石形状流动通道。芯片的底部有48000个孔，排成48行和1000列的六角形阵列，间距为60µm，圆的直径为15µm，圆的深度为10µm。这种模式决定了磁柱的设计，旨在提供最佳的电池捕获效率。

为了进一步证明PLA信号在芯片上实现的特异性，作者使用siRNA敲低了SK-BR-3细胞系中的HER2和/或HER3基因。作者对HER2和HER3分别以及联合进行了基因沉默。作者观察到，在siHER2或siHER3处理的细胞中，每个细胞的PLA信号数量显著减少，当HER2和HER3基因均被敲低时，PLA信号数量甚至更多（下图c）。作者观察到，在HER2/HER3敲低的细胞中，PLA信号的平均值从132个信号/细胞下降到24个信号/细胞（下图c）。总之，这些结果证明了ctc检测的特异性，并证实了Ephesia芯片捕获的上皮细胞状态可以结合PLA在单细胞水平定量和特异地评估HER2-HER3二聚化事件。

实现片上PLA来分析单个ctc需要大量重新设计Ephesia工作流程。

为了证明这种检测的临床潜力，作者对转移性乳腺癌（MBC）患者的血液样本进行了相同的分析。与细胞系实验类似，作者在每个患者样本的芯片上进行了CTC捕获、HER2-HER3 PLA以及用于CTC鉴定的免疫染色（DAPI+、CK+、CD45 -）。下图a展示对来自HER2−(01-435)或HER2+(01-444)患者的血液实施的实施例。接下来，作者描述了在检出CTC的每例患者中，每个CTC的PLA信号分布（下图b）。作者观察到HER2-HER3 PLA谱的广泛异质性（下图b）。约1 / 3患者的PLA信号平均值较低且分布较窄，而其余患者的HER2- HER3二聚体事件分布较多。

这些数据证明了通过芯片CTC捕获、PLA鉴定、蛋白marker染色，直接从血液样本中评估单个CTC的HER2-HER3状态的可能性。然而，未来应该分析更多的样本，以进一步评估这种状态如何与患者对治疗的反应相关。

参考文献

1.Weibrecht I, Leuchowius KJ, Clausson CM, Conze T, Jarvius M, Howell WM, Kamali-Moghaddam M, Söderberg O. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 2010 Jun;7(3):401-9. doi: 10.1586/epr.10.10. PMID: 20536310.

2.Tulukcuoglu Guneri E, Lakis E, Hajji I, Martin E, Champ J, Rampanou A, Pierga JY, Viovy JL, Proudhon C, Bidard FC, Descroix S. Deciphering HER2-HER3 Dimerization at the Single CTC Level: A Microfluidic Approach. Cancers (Basel). 2022 Apr 8;14(8):1890. doi: 10.3390/cancers14081890. PMID: 35454795; PMCID: PMC9026778.

3.Dianat-Moghadam H, Azizi M, Eslami-S Z, Cortés-Hernández LE, Heidarifard M, Nouri M, Alix-Panabières C. The Role of Circulating Tumor Cells in the Metastatic Cascade: Biology, Technical Challenges, and Clinical Relevance. Cancers (Basel). 2020 Apr 3;12(4):867. doi: 10.3390/cancers12040867. PMID: 32260071; PMCID: PMC7225923.