荧光定量PCR的一些思考

故事起源于有一个小伙伴说，RT-PCR这个我熟。之后，事情就一发不可收拾了。因为光收集名字就有N种，FQ-PCR、TaqMan PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR……

查阅MIQE（MIQE代表 实时荧光定量 PCR实验出版物中最小信息量，是一套实时荧光定量PCR (qPCR)实验设计及数据报告实践指南以及与同事共享实验信息的标准。该标准旨在确保发布的实时荧光定量PCR研究有意义、准确，并为研究人员提供客观再现结果所需的信息），看来大佬对这个问题也很头疼。原文翻译总结如下：

qPCR为Quantitative real-time PCR的简称，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR仅用来表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少数作者并没有坚持这一原则。

下面全是个人经验了，如有错误，请理性讨论。

原理

qPCR其核心原理同PCR一致，无论用什么方法本质上都要用到PCR扩增。这样做的根本目的就是放大信号，只不过定量检测的不是终点，这样有更高的灵敏度，更好的重现性，对起始量更敏感。

核心原理离不开扩增

qPCR是用于定量，那么其信号检测位点也就只剩下两个位置，一个是PCR产物，一个扩增引物。

通过检测每轮的产物来确定量的方法就是染料法。SYBR® Green I染料是一种荧光DNA结合染料，可与双链DNA的小沟结合。该方法受限于原理，不具有特异性，只要是双链DNA都可以染色。

染料法检测每轮PCR产物双链DNA。

如果将检测信号加到引物上就是探针法了，比如我们常说的TaqMan探针，其只是探针的一种其余的还有如MGB探针、双淬灭探针、锁核酸探针等等探针。本质就是要在每一轮的循环中增加荧光强度。

TaqMan探针为例，在每轮PCR的延伸阶段检测不被抑制的荧光强度

深入分析原理后就可以知道了，染料法简单，但是只能检测一个位点，相对的探针法虽然复杂，但是就能检测多个位点了，但是不管哪种方法都需要进行引物扩增，一致性的扩增效率是引物设计的重点。

应用

定量，本命应用

既然是实时荧光定量PCR，其最本命的应用就是定量了，分为相对定量和绝对定量。

相对定量，就是用结果去比较稳定的结果。稳定的结果用于归一化，在MIQE叫做参考基因，而不是管家基因。只是实验中常用管家基因作为参考基因，所以相对定量的结果理论上没有一个准确的值，都是比出来的。

绝对定量，在做实验的时候加标准品，标准品是有准确浓度值的，通过标准品算出标准曲线，算出结果浓度。

注意相对定量中有两种算变化的方法ΔΔCt法和标准曲线法，注意和决定定量的标曲区分。

高级应用，玩转荧光

熔解曲线

双链DNA结合染料产生荧光，那么单链就不结合染料产生荧光了。在 40个循环之后，扩增产物退火，并发出大量荧光。当 熔解曲线分析开始后，实时荧光定量 PCR 仪缓慢升温，同时记录扩增片段的荧光数据。随着 PCR 产物开始变性 (或熔解)，荧光染料释放，荧光强度慢慢下降，直到温度接近 PCR产物的 Tm。在接近 Tm时，随着样本从双链解离为单链 DNA，可观察到荧光强度显著下降。

多重实时荧光定量 PCR

该方法只能用探针法，一管PCR中存在多对引物，每一个探针用不同的荧光基团，这样通过检测不同光谱，能够检测多个点。受限于荧光试剂种类，光谱干扰等原因，并不是想检测几个荧光都可以，一般来说5-7个就是大多数实验的上限了。

其他应用

举个例子，结合ARMS-PCR(突变扩增阻滞系统PCR)，在扩增引物上做手脚，匹配上的扩增，匹配不上的不扩增，这样就只有一种位点能发光。进一步修改，匹配序列1的法绿光，匹配序列2的发红光，这样就能检测三种位点。另一种修改，将荧光基团加到扩增引物5‘端，通过扩增条带的长短进行电泳分离，这又是对荧光的另一种应用。

同样的，减少探针长度，利用其特异性，不同探针加不同荧光基团，通过检测不同荧光区分一对PCR产物的不同序列变化。

抛砖引玉，全文至此结束。