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关于磁珠使用的几个小问题?

2024-12-19 16:09| 编辑: 归去来兮| 查看: 281| 评论: 0|来源: 分子庄园

摘要: 一些磁珠需要避光保存,如修饰有荧光基团的磁珠。


磁珠试剂瓶放置于冰箱2-8℃保存时,要注意试剂瓶不能贴壁,避免冰箱启用除霜功能时造成悬液结冰失效。磁珠试剂瓶宜置于冰箱中部,避免靠壁。


b.避免长时间室温放置


长时间常温放置也会影响磁珠的回收性能,因此磁珠用完后请及时放回4℃,特别是一些免疫蛋白或链霉亲和素修饰的磁珠。


图片来源:链霉亲和素偶联的 Dynabeads?顺磁微珠直径 1 μm,羧基亲水,2ml - 佑研匠簇网上商城
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庄主推荐:液相杂交捕获


c.避光保存


一些磁珠需要避光保存,如修饰有荧光基团的磁珠。


图片来源:一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法及在免疫层析中的应用与流程


d.避紫外线


室温平衡时应避免阳光直射,以防紫外线损伤;使用中也应避免紫外光照。


图片来源:《自然》系列:一般紫外线只能够杀细菌 这种紫外光却够杀流感病毒-医牛健康资讯

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e.冷链运输

推荐冷链2-8℃运输。小包装产品用泡沫盒子加冰袋也能短时间运输,但冰袋和磁珠试剂瓶/管之间需用传热性能低的泡沫或塑料隔开,避免装磁珠的试剂瓶/管直接接触冰袋。


2、磁珠冷冻后会发生什么?


a.磁珠团聚易沉降


冷冻、干燥和离心都会引起磁珠团聚而无法再分散,导至磁珠性能失效。


图片来源:YJ011 链霉亲和素磁珠_价格-厂家-供应商_上海雅酶生物科技有限公司_丁香通


b.结构破坏,性能失效


过低的温度(如-20℃)会破坏磁珠结构及表面修饰,影响磁珠抓取效率。



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ⅰ.纯化磁珠DNA回收效率低,回收特异性下降,回收得到的DNA杂质多。


ⅱ.oligdt磁珠失去效能,不再特异性抓取mRNA,建库得到的文库为总RNA文库。


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ⅲ.链霉亲和素磁珠失去效能,杂交捕获洗脱得到的文库捕获效率及低,文库浓度偏高。


3、免疫磁珠在使用过程中出现聚集或挂壁情况的原因?


a.正常情况


免疫/链霉亲和素磁珠具有带负电荷的表面,磁珠在低pH的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象,不影响磁珠的正常使用。


b.非正常情况


ⅰ.可能是由于β-巯基乙醇、DTT、pH差值大等因素,影响磁珠的均一性,使得磁珠粘稠,导至聚集成块或出现挂壁的现象。


ⅰ.在Binding buffer和Elution buffer中添加终浓度为0.1%(v/v)的非离子型去垢剂(如NP-40、Tween-20或Triton X-100)可有效防止磁珠聚集。


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ⅱ.经过低pH操作的磁珠可以用结合缓冲液洗涤至中性,然后用含有0.1%(v/v)Tween-20的Tris buffer(pH7.5)振荡重悬磁珠。

ⅱ.磁珠pH值异常


磁珠的pH值可能会因为受到酸碱性物质的影响而发生变化,导至结块。在使用磁珠时,要注意保持合适的pH值。


ⅲ.离心过久


在洗涤步骤中,磁珠离心时间过久,可能导至磁珠颗粒间的结合力增强,形成结块。磁珠在磁场中放置太久也会使磁珠牢固的结合在一起。


图片来源:12孔磁力架(1.5/2.0ml)--性能参数,报价/价格,图片_生物器材网


4、如何解决磁珠易粘附管壁的现象?


粘性可能是由于磁珠之间或磁珠与管壁之间的静电相互作用造成的。通常,建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。


图片来源:干货分享|磁珠常见问题与解决方案-翌圣生物


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另外,建议在进行实验之前,用诸如Tween 20去污剂的非离子去污剂洗涤磁珠。这种处理可以降低磁珠的静电电势。


通常只需将Tween 20去污剂加入到磁珠中,最终浓度可达到0.1%,然后在不含去污剂的缓冲液中重悬并洗涤磁珠,就可以减少或消除这个问题。可能需要在Tween 20溶液中孵育,例如在室温下滚动孵育 5-10分钟。


在缓冲液中添加0.01%~0.1%(v/v)的非离子型去垢剂(如NP-40、Tween-20或TritonX-100)也可以有效降低磁珠对耗材的粘附。


5、磁珠可以吸附ssDNA和RNA吗?


不管双链DNA、单链DNA,还是RNA,都可以在溶液中解离出带负电的磷酸基团,因此都可以用磁珠进行纯化回收,但单链DNA和RNA都没办法进行片段大小筛选。


图片来源:5min了解DNA磁珠的前世今生(含结果分析及FAQ解读)-翌圣生物

双链DNA的二级结果一般是一条较稳定的线性双螺旋分子,在PEG的存在下,解离出来带负电的磷酸基团多少和其长度正相关,而RNA和单链DNA,二级结构比较复杂,导至其裸露出来的负电基团无法跟长度呈正相关,所以没办法像DNA那样进行片段筛选。


另外RNA和DNA在不同pH下稳定性不一样,所以纯化RNA的磁珠buffer中pH和纯化DNA的磁珠是不一样的。


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6、建库纯化磁珠可以纯化gDNA吗?

可以,但由于大DNA与磁珠结合的非常紧,建议尽量增加洗脱液体积和洗脱孵育时间、建议高温孵育和边洗脱边震荡。


7、用磁珠纯化RNA时,为避免RNA降解,可以放在冰上孵育么?

不可以,一般是置于4℃孵育并适当延长孵育时间。不推荐放置在碎冰上孵育。

8、磁珠的DNA结合能力怎么样?该担心磁珠不够么?

在目前的磁珠体系中,磁珠的吸附能力均为过饱和,不必担心磁珠结合能力不足的情况。根据已知的报道,每1μL磁珠可以结合7μg DNA。

9、如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性?

可以先将抗体与样品进行孵育,形成抗体-抗原复合物,再用ProteinA磁珠捕获复合物。


庄主推荐:如何打开 “ 染色质免疫共沉淀技术(ChIP)” ?

这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率,并降低磁珠与样品接触的时间,从而提高沉淀产物的特异性。

参考资料

[1]磁珠的保存法,磁珠的保存条件。磁珠使用注意事项。- 知乎中科科优

[2]5min了解DNA磁珠的前世今生(含结果分析及FAQ解读)-翌圣生物

[3]磁珠在保存、运输及使用前的建议-博兰鹰

[4]磁珠常见问题及对策-化工仪器网-手机版

[5]磁珠回收DNA和片段筛选 - 知乎秉聿随记

[6]干货分享|磁珠常见问题与解决方案-翌圣生物

[7]Dynabeads磁珠核酸纯化支持——问题排查 | Thermo Fisher Scientific - CN

[8]磁珠法核酸提取过程中的6种常见误区-分析测试百科网

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