知识类｜二代测序NGS文库构建的常见问题解析

二代测序NGS的文库构建对于测序的结果影响至关重要，文库构建后，通常进行文库长度和浓度的质控，从而决定后续的上测序仪操作。

文库构建中出现了异常问题，如文库两端未能成功连接上功能接头或者文库纯化不完全含有接头引物二聚体等，这些会导至文库预期片段长度或预期长度片段占比的改变，因此通过检测文库片段长度可以发现这些问题。

文库的浓度和测序芯片长簇的密度直接相关，簇密度过高或过低都会影响结果的成功性或测序成本，因此文库的浓度质控可以在测序前实现对文库浓度的精准调控。

目前文库片段长度质控一般使用毛细管电泳仪器，而文库定量则使用荧光定量PCR或荧光染料检测法仪器如Qubit来进行。这里注意的是，进行定量时，使用荧光定量PCR法是利用特异性引物靶向文库中两端接头，这样可避免文库两端未能成功连接上功能接头的样本浓度的干扰。而荧光染料检测法是测量所有双链片段浓度，无法区分两端结果未成功接上的样本的对浓度测量的干扰，但是荧光染料检测法操作则更为便利。

常见问题1：文库片段长度小于预期。可能原因包括原始样本发生了降解，或者样本提取后片段化处理时间过长或者处理温度不合适。解决方法包括增加原始样本质控方法，确认样本的完整性，遇到完整性不好的样本，可以适当加大建库样本上样量，另外对于片段化处理，减少片段化时间和优化片段化的温度，得到预期的文库片段长度。

常见问题2：文库片段长度大于预期。可能原因是片段化处理时间过短或者处理温度不合适，或者提取时残留的一些物质抑制了片段化酶，影响了片段化效果。解决方法包括增加片段化时间和优化温度，或者去除片段化酶的抑制污染物。

常见问题3：毛细管电泳检测片段时基线不平产生波动：可能原因是纯化不完全，导至了磁珠残留在溶液中，解决方法是使用磁力架重新去除磁珠。

常见问题4：产物除了有预期峰外，还产生了一个异常的较大峰：可能原因是PCR的循环数过多，导至了引物消耗完后，发生了文库和文库之间的反应，解决方法是减少PCR的循环数。

常见问题5：产物除了有预期峰外，还产生了一个异常的较小峰：这个较小的峰一般是接头的二聚体，若接头二聚体量较多时，可以通过磁珠纯化方式将其消除。