从分子层面剖析核酸纯化的原理

核酸纯化是分子生物学中的一项关键技术，第三方医疗检测机构的NGS检测涉及从血浆、全血、骨髓、羊水、石蜡组织等样本中纯化DNA或RNA。为了理解核酸纯化及后续流程，技术员需要掌握分子生物学的基础知识，包括碱基、核酸、基因、染色质与染色体、细胞核、核膜、细胞质、细胞膜及组织的结构特点。以下是对这些基础知识与核酸纯化过程之间的关系的详细阐述。

01 核酸相关的基本概念

• 碱基：核酸的基本组成单位是核苷酸，核苷酸由一个磷酸、一个糖分子和一个含氮的碱基组成。DNA中有四种碱基：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）；RNA则用尿嘧啶（U）替代胸腺嘧啶。

• 核酸：核酸是由核苷酸（nucleotide）构成的，而每个核苷酸由三部分组成：一个含氮的碱基、一个分子五碳糖（脱氧核糖或核糖）和一个磷酸基团（磷酸基团上的氧原子带有负电荷，使核酸在水溶液中带负电荷）。碱基通过氢键的作用力，利用互补配对原则（如A-T、G-C），结合形成稳定的双链结构。根据组成不同，核酸分为DNA和RNA。DNA是遗传信息的载体，而RNA在基因表达和蛋白质合成中发挥重要作用。

• 基因：基因是DNA的功能单位，每个基因由特定序列的DNA片段组成，这些序列包含编码蛋白质或调控RNA分子的指令。基因的主要功能是通过指导合成蛋白质来表达遗传信息，这些蛋白质在细胞中发挥各种生物功能。基因的结构包括启动子、外显子和内含子等。

• 染色质与染色体：DNA与组蛋白等蛋白质结合形成染色质，染色质是细胞核内DNA的主要形式。在细胞分裂时，染色质凝缩成染色体，以确保遗传物质的正确分配。每个人的细胞通常含有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为性染色体，承载着所有的遗传信息。

02  细胞与组织的结构特点

• 细胞核：细胞核是细胞中最重要的结构之一，包含细胞的遗传物质（DNA）。核膜将细胞核与细胞质分隔开，控制核内外物质的进出。

• 核膜：核膜由两层脂质双层组成，主要成分是磷脂、胆固醇及膜蛋白。

• 细胞质：细胞质是细胞核外的部分，包含细胞器和细胞间质。在核酸提取中，细胞质中的核酸酶可能会导至DNA或RNA的降解。

• 细胞膜：主要由磷脂双层、蛋白质和糖类组成。磷脂分子由亲水的头部和疏水的尾部组成，形成双层结构，内外表面有不同类型的膜蛋白。膜蛋白的存在使得细胞膜具有多样的功能，如信号传导和细胞识别。细胞膜的完整性在裂解过程中需要被打破，以释放细胞内的核酸。

• 组织：相同或相似的细胞通过黏附分子（如跨膜蛋白、钙黏蛋白、整合素等）相互连接，形成更大的结构单元，即组织。组织在身体中发挥特定功能。人体的所有器官和系统都是由不同类型的组织构成的。

03 分子生物学知识应用于核酸纯化过程

核酸纯化通常分为裂解、结合、洗涤和洗脱四个步骤，每个步骤都与分子生物学的基础知识密切相关。

1. 裂解

• 原理：裂解液的主要成分是表面活性剂（如SDS），用于破坏细胞膜和核膜。通过与蛋白酶（如蛋白酶K）的协同作用，能够有效释放细胞内的核酸，并降解蛋白质。

• 分子机制：表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），是一种常用的阴离子表面活性剂。其分子结构具有亲水性和疏水性两部分，通过插入细胞膜与核膜的脂质双层中，导至膜的破裂和不稳定，从而使细胞内容物释放到外部环境中，主要负责物理性地破坏细胞膜和核膜。而蛋白酶K则通过降解膜蛋白和细胞内蛋白质（包括核酸酶），确保核酸的完整性和纯度。这两者在裂解过程中相辅相成，都是实现有效裂解和核酸释放的重要成分。

2. 结合

• 原理：通过调节盐浓度，促进核酸与磁珠的结合，确保核酸在后续步骤中能被有效分离和纯化。

• 分子机制：核酸分子的磷酸骨架带负电，而载体（如磁珠或硅基柱）也通常带负电。在低盐环境中，核酸与载体之间的排斥力较大，难以结合。在高盐条件下，阳离子（如Na+或胍盐中的离子）会屏蔽核酸和载体表面之间的负电荷，使得它们能通过氢键和疏水作用等非电荷相互作用结合。高盐溶液是核酸结合的关键。

3. 洗涤

• 原理：洗涤步骤使用低盐缓冲液和乙醇洗液去除残留的蛋白质、盐类和其他杂质，确保最终提取的核酸的纯度。

• 分子机制：

  在高盐环境下，核酸（如DNA或RNA）的磷酸骨架带负电荷，通过静电相互作用与磁珠表面的正电荷结合，通常磁珠表面包裹有硅基材料。当用低盐缓冲液洗涤时，离子强度降低，非特异性吸附的杂质如残留的蛋白质和离子类物质得以解离，但核酸与载体之间的结合仍然稳定。低盐缓冲液的离子强度不足以破坏核酸-载体的结合，但能削弱蛋白质等杂质与核酸的相互作用，因而有效去除这些杂质。

  乙醇是一种有机溶剂，能改变溶液的极性，减少核酸和水分子的相互作用。乙醇会使水和水溶性杂质（如溶解在水中的盐类）远离核酸。由于核酸在较高浓度乙醇溶液中不易溶解，因此在乙醇洗涤时，核酸仍然牢固地结合在磁珠上，而残留的盐类和水分被乙醇溶液带走。

4. 洗脱

• 原理：在洗脱步骤中，通过低盐缓冲液或水打破核酸与磁珠之间的静电作用，从而释放核酸。

• 分子机制：在之前的高盐条件下，阳离子（如Na⁺或胍盐中的离子）中和了核酸磷酸骨架与载体（通常带负电）的负电荷，从而允许核酸与载体结合。在洗脱步骤中，通常使用低盐缓冲液或无核酸酶水，其盐浓度显著降低，导至阳离子数量减少，屏蔽效应被解除。核酸和载体表面的负电荷恢复，带来相互的排斥力，破坏了它们之间的结合，导至核酸从载体上被释放出来。

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作者简介：涓涓细流，一个想要为NGS检验工作人员做点事的人，希望以此提高大家的专业水平，减少检验质量事故发生的概率，为患者服务。纤纤不绝薄成林，涓涓不止江河生！