双链核酸的序列特异性识别对于分子诊断和原位成像至关重要。CRISPR系统已经彻底改变了基因组编辑、表达干扰和分子诊断领域。Cas蛋白介导引导RNA（gRNA），通过识别PAM序列来切割目标核酸。此外，在目标识别时，也有一些Cas蛋白对单链报告核酸表现出不加区分的切割活性。然而，CRISPR-Cas系统的PAM依赖性和脱靶效应不仅限制了其目标，但也对识别特异性提出了挑战。这激发了一种对dsDNA进行序列特异性识别的新工具。 近日，杂志Nature biotechnology上发表了一篇题为“Bacteriophage λ exonuclease and a 5′-phosphorylated DNA guide allow PAM-independent targeting of double-stranded nucleic acids”的文章。作者发现了噬菌体λ外切酶(λExo)的酶活性。5 ' -磷酸化的单链DNA (pDNA)可以与dsDNA和DNA-RNA双链上的互补区域结合，λExo在Mg2+存在下会将pDNA消化成核苷酸。该过程对pDNA结合区域内的错配非常敏感，不需要特定的基序。λExo-pDNA可用于检测病原体基因，且识别突变不需要特定的基序，也不需要额外的报告基因，与各种比色或测向流动技术兼容。此外，λExo-pDNA也可用于基因组位点成像。总的来说，作者证明了λExo-pDNA系统是分子诊断和基因成像应用的多功能工具。 图片来源：nature biotechnology 主要内容 λExo-pDNA结合dsDNA的smFRET研究 噬菌体λ外切酶（λExo）识别5’-磷酸化的dsDNA，并降解5’-磷酸化链，留下3’overhang。λExo对非磷酸化DNA和单链DNA（ssDNA）催化活性较低。作者采用TIRFM进行smFRET检测，研究λExo介导的dsDNA结合（下图a）。当dsDNA靶点（45bp的dsDNA）与pDNA长度相同时，观察到显著高FRET状态，表明pDNA在λExo的帮助下与靶点结合，其fbound达到0.86。随着目标核酸长度的增加（85-bp的dsDNA），fbound减少到0.52。当pDNA与DNA-RNA双链靶标的DNA序列互补时，fbound略低于45bp的dsDNA，原因是DNA-RNA双链的稳定性增加。此外，λExo介导的结合对单一错配很敏感。互补区中间和5‘端附近的错配有效地阻碍了pDNA的结合（下图e）。
λExo-pDNA与dsDNA的结合。 图片来源：nature biotechnology 在Mg2+存在下，λExo对pDNA的酶切反应 作者设计了pDNA与cy3标记和cy5标记的链杂交产生荧光信号的结构，形成较高FRET。一旦pDNA链被λExo消化，将导至EFRET值下降（下图a）。在100秒的时间范围内，45bp的dsDNA 分子有75.2%发生EFRET降低；45bp的DNA-RNA双链分子有63.1%发生EFRET降低；85bp的dsDNA分子有42.4%发生EFRET降低；200bp的dsDNA分子有41.7%发生EFRET降低。 pDNA的消化活性对5‘端和互补区中间附近的错配也高度敏感。大多数分子在100 s内没有表现出荧光状态转变。这可能是由于λExo-pDNA与不匹配的靶点的结合亲和力较低。fbound与消化率呈线性关系，说明λExo-pDNA与靶标的结合亲和力决定了催化效率（下图f）。
目标核酸在Mg2+存在下诱导pDNA酶降解。 图片来源：nature biotechnology 利用pDNA探针检测ds-核酸 作者开发了一种稳健而快速的方法来检测ds-核酸。将荧光团标记的链和猝灭剂标记的链与pDNA链杂交，导至荧光猝灭。靶标的存在诱导了pDNA的酶促消化，导至荧光的恢复。所有完美匹配的靶标在30 min内都显示出显著的荧光增加（图b）。pDNA探针在浓度低至0.1 nM时即可检测到目标dsDNA（图c，d）。且所有类型的不匹配信号平均比来自匹配目标的信号低10倍（图e）。为了评估低丰度突变体序列的检测能力，作者选择了四种具有代表性的错配类型。在存在许多不匹配序列的情况下，该方法成功地检测到了完全匹配的序列，其丰度为0.5%（图f）。
荧光法λExo-pDNA检测ds-核酸。 图片来源：nature biotechnology 病原体基因的体外检测 提取SARS-CoV-2 RNA，通过逆转录和重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）进行扩增。分别设计用FAM和ROX染料标记的pDNA探针检测E和N基因。结果显示每微升1拷贝阳性样本与阴性对照之间E和N基因的荧光信号存在显著差异（图b）。临床阳性拭子样本中这两个基因的荧光明显强于阴性样本（图c）。 作者还证明了λExo-pDNA在分子诊断中的普遍性。ESKAPE病原体、粪肠球菌（ddl基因）、金黄色葡萄球菌（nuc基因）、肺炎克雷伯菌（mdh基因）、鲍曼不动杆菌（gltA基因）、铜绿假单胞菌（oprL基因）和大肠杆菌（dnaJ和ampC基因）。作者设计了针对上述基因片段的pDNA，结果显示λExo-pDNA探针在有靶基因存在的情况下表现出显著的荧光变化，而在没有靶基因存在的情况下没有发现荧光增加（图d）。
病原体的体外检测。图片来源：nature biotechnology 病原体突变型的体外检测 为了证明λExo-pDNA的多重检测能力，采用多路RPA生成dsDNA靶标。用FAM、ROX和Cy5标记3个正交的pDNA，检测S基因的保守序列和编码D614G和N501Y点突变的序列。当pDNA探针被设计成与突变体序列完全匹配时，突变体序列表现出比野生型要高得多的荧光（图g）。从相应的信号强度中可以推断出来自不同突变体和野生型组合的DNA的存在（图h）。这些结果证实了使用pDNA探针与单一酶可以实现多重检测。 总的来说，λExo-pDNA可用于检测病原体基因，且识别突变不需要特定的基序。pDNA可以作为报告基因，不需要额外的报告基因。
病原体突变型的体外检测。 图片来源：nature biotechnology 原位基因成像 荧光原位杂交（FISH）在细胞基因组成像中得到了广泛的应用。λExo-pDNA也可用于基因组位点的原位成像。为了抑制λExo的核酸酶活性，在成像缓冲液中使用Ca2+，而不是Mg2+。使用λExo-pDNA，作者成功地标记了多个端粒位置，与DAPI共定位（图b）。在分析的210个细胞中，端粒数量为49~103个，平均为73个（图c）。λExo-pDNA和标准DNA FISH斑点之间存在高度的共定位（图e）。两种方法鉴定的端粒总数分布完全匹配（图f)。
原位基因成像。图片来源：nature biotechnology 总结与讨论 作者发现了噬菌体λ外切酶(λExo)的酶活性。5 ' -磷酸化的单链DNA (pDNA)可以与dsDNA和DNA-RNA双链上的互补区域结合，而不需要PAM样基序。结合后，λExo-pDNA系统在Mg2+存在下催化将pDNA消化成核苷酸。该过程对pDNA结合区域内的错配非常敏感，从而在各种应用中具有特殊的序列特异性和减少脱靶效应。不需要特定的基序，如PAM序列，极大地拓宽了靶标的范围。λExo-pDNA可用于检测病原体基因，且识别突变不需要特定的基序，也不需要额外的报告基因，与各种比色或测向流动技术兼容。此外，λExo-pDNA也可用于基因组位点成像。总的来说，作者证明了λExo-pDNA系统是分子诊断，DNA计算和基因成像应用的多功能工具。 此技术未来的发展方向。首先，由于pDNA探针设计的灵活性，通过一次λExo周转可以释放多个报告链。因此，可以进一步增强核酸检测的荧光信号强度。其次，可通过优化pDNA的长度，或开发λExo的变体，进一步提高对单核苷酸错配的选择性，用于检测临床样本中的低频突变，如循环肿瘤DNA。第三，优化实验组分和浓度，有助于实现一锅反应。最后，开发λExo变体，保留目标结合活性，同时消除核酸酶活性，从而能够在活细胞中进行成像。 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
