呼吸道病原体对公共卫生构成重大挑战，需要有效的诊断方法。在临床环境中，混合感染的准确诊断具有挑战性，尤其是对于可能同时感染多种病原体的肺炎患者，及时准确的病原体检测不仅是传染病诊断的基础，而且可以指导个性化治疗方案的选择，确保适当使用药物。磁控微流控芯片技术已成为核酸提取和检测的热点，有效解决了传统方法中遇到的与液体转移相关的挑战。该技术有利于提高核酸提取效率，同时减轻气溶胶污染的风险。此外，它将核酸提取、洗涤、洗脱和检测集成到单个芯片中，便于自动化控制。表面张力辅助的不混溶相过滤（IFAST）是设计用于核酸提取的磁控微流控芯片中最常用的技术。该方法利用水相和油相之间的界面处的表面张力，产生有效地分离不同腔室中的试剂而没有干扰的虚拟屏障。由外部磁场引导的磁珠在两相之间快速移动，以促进从样品中提取核酸。这种在微流控芯片中提取核酸的方法已被广泛应用。之后提出了一种利用油浸无损全分析系统（Oil-tas）概念的微流体装置，旨在简化工艺和扩展磁控微流控芯片功能。在该系统中，将液滴固定在充油室中，并且磁珠在液滴之间穿过以进行核酸提取和纯化。这种创新的设备将RNA提取与环介导等温扩增（LAMP）检测无缝结合，证明了在低至10 copies/μL下对SARS-CoV-2病毒的可靠检测。然而，这些策略中的大多数是为检测单一病原体而定制的。目前研究将微流控芯片技术与分子生物学技术如PCR，LAMP和RPA相结合，以实现多重核酸扩增和多病原体检测。但仍存在一些局限性,这些限制包括需要精确控制系统的复杂芯片设计、不能满足早期诊断需求的不足灵敏度以及对昂贵仪器的需求。本文（Simultaneous
Detection of Multiple Respiratory Pathogens Using anIntegrated Microfluidic
Chip）提出了一种基于集成微流控芯片的PCR策略，用于高效、灵敏地同时检测12种呼吸道病原体。
该芯片集成了四个不同的功能区，可实现基于磁珠的核酸提取和纯化、声流驱动磁珠混合、液体均衡、在四个独立的孔中进行多重PCR扩增，并进行原位荧光检测（如图1A）。通过设计的微柱和气泡捕获阵列结构的组合来实现磁珠的有效混合。微柱在将油包封的水滴系统内的磁珠混合区与核酸纯化区隔离中起着至关重要的作用，从而确保磁珠在水相系统中的有效混合。当腔室充满水相时，气泡捕获阵列结构通过表面张力产生气泡。在由压电换能器（PZT）引起的声场下，这些气泡剧烈振动，从而产生声流。该动态过程充当微混合器，有效地将磁珠混合在水相系统内。在充分混合之后，芯片利用油相将水相驱动到四个相等体积的室中，确保磁珠混合物的均匀分布。在整个研究过程中，最初评估了声流驱动磁珠混合的有效性。随后，通过比较芯片上和芯片外提取的核酸的ct值来验证芯片用于核酸提取的性能。在此之后，研究了芯片在单个芯片内同时定性和定量检测多种病原体的能力。使用12种呼吸道病原体的质粒作为模型进行了证明，包括人副流感病毒1（HPIV-1)，甲型流感病毒（FLUA )，人鼻病毒（HRV)，人腺病毒（HADV)，呼吸道合胞病毒-A （rsv-a），乙型流感病毒（FLUB），肺炎链球菌（SP），人巨细胞病毒 (HCMV)，人偏肺病毒（HMPV)，肺炎支原体（MP），肺炎衣原体（CP），以及嗜肺军团菌（LP）。最后，该方法成功地用于检测含有单个病原体（rsv-a，SP，HADV，FLUA和MP）的临床鼻拭子样品。以及混合物（rsv-a & SP和HADV & FLUA
& MP），证实了这种芯片上测定的实际效用，尤其是其优异的多病原体分析能力，能够准确检测单一病原体和混合感染病原体。此外，该测定也表现出优异的稳定性。与各种基于微流控芯片的分子生物学方法检测多种呼吸道病原体相比，该方法提供了优越的性能，包括10 copies/uL的低检测限，从样品加载到荧光读出约70 min内的快速结果，以及优异的多病原体检测能力。
图1.用于同时检测多种呼吸道病原体的集成微流控芯片。（A） 芯片结构和功能分区的示意图 （i），（ii） 和 （iii） 表示微柱的示意图，显示了它们之间的距离。（B） 核酸提取和纯化区的顶视图和侧视图。（C） 气泡阵列结构的示意图: 蓝色表示双蒸水，从左向右平稳前进以形成气泡。PZT提供声波诱导微流实现有效的混合。（D） 12种病原体 （包括细菌和病毒） 的多重荧光检测的示意图。总结： 本研究展示了一种先进的集成微流体装置，能够在单个芯片上同时检测12种呼吸道病原体。从样品加载到荧光读出的整个工作流程仅需要70分钟。创新的设计具有矩形腔室和具有可变间隙的微柱，有助于有效执行芯片的整个操作过程。另外，油包封的水滴系统的并入有效地减轻了试剂污染的风险，试剂污染是传统管内PCR方法中的常见问题。与各种基于微流控芯片的分子生物学方法相比，该测定表现出相当或优越的灵敏度和速度，使其成为现场同时诊断和监测各种病原体感染的有希望的工具。
参考：Jun Li, Zehang Gao, Chunping Jia, et al. Simultaneous Detection of
Multiple Respiratory Pathogens Using anIntegrated Microfluidic Chip. Anal.Chem. 2024,96,13768-13776. 声明：本文仅做学习交流，非商业用途。
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