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简单比较不同的化学发光技术

2024-10-8 18:07| 编辑: 归去来兮| 查看: 662| 评论: 0|来源: PBSolutions

摘要: 吖啶酯、吖啶磺酰胺是直接化学发光的代表,无须催化直接发光。


主流的化学发光平台



1.直接化学发光(吖啶酯或吖啶磺酰胺)

吖啶酯、吖啶磺酰胺是直接化学发光的代表,无须催化直接发光。属于闪光型。四大家中雅培用的是吖啶磺酰胺,西门子Centaur系列用的是吖啶酯。

(图片来自于网络)   

2.酶促化学发光

常见的酶促发光平台有辣根过氧化酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP),这种发光是需要酶催化底物而产生光信号,而且光信号是辉光型。AP酶代表化学发光试剂厂家:贝克曼、迈瑞等,HRP代表厂家安图。

(图片来自于网络)

3.电化学发光

常见的是以三联吡啶钌标记抗体,以三丙胺(TPA)为电子供体,在电场中发生电子转移而发光化学发光反应。代表厂商就不用多说了,四大家中有罗氏,国内的厂商中有普门、联众泰克、安赛等。

(图片来自于网络)

电化学发光高端但也想对小众,国内主流的仍然以吖啶酯(AE)和碱性磷酸酶(AP)两个发光平台为主。2019年底我们调研,AE和AP两个试剂厂家占比大概是50%:50%;到2022年底,我们再次的调研结果成了60%:40%。AE的“玩家”占了上风。现在到了2024年,AE的比例似乎更高了。

因为很多新进入发光领军的“玩家”都会选择AE平台。我们也问过一些客户他们选择AE发光平台的考量是什么,总结起来答案有两种:

1.这个工艺、方法比较简单;

2.成本比较低。

那这两种方法学的差异大吗?

下面,基于行业的一些经验,介绍吖啶酯(AE)和碱性磷酸酶(AP)两种发光的特点。




吖啶酯(AE)和碱性磷酸酶(AP)

两种发光的特点




1.吖啶酯化学发光

国内最常用的吖啶酯或吖啶磺酰胺其实只有以下两种。

发光基理也差不多,如下图:

那么,吖啶酯(吖啶磺酰胺)化学发光的特点是什么?

  • 标记相对简单——蛋白与吖啶酯(磺酰胺)直接孵育、透析即可

  • 无需催化剂——碱性环境的H2O2即可直接激发发光

  • 无需增强剂——本底低,信噪比高

  • 双底物组分——需要预激发液和激发液

  • 闪光型——发光信号持续时间很短,对发光仪要求高

但我们从一些文献中也获取到一些信息,比如西门子早期就做了大量的研究,他们研究了很多不同结构的吖啶酯对试剂性能的影响。

Analytical Biochemistry 406 (2010) 204–213 

研究表明,不同的项目或者说不同的抗体,最适合的吖啶酯(吖啶磺酰胺)的结构其实是不一样的。换句话说,要想让试剂达到最佳的性能,这个抗体连哪种结构的吖啶酯,是不是都要试一遍?据说,雅培内部也有各种各样结构的吖啶磺酰胺。所以,从这个角度来说,AE发光试剂的开发也不见得就简单。之所以觉得简单,可能我们还没有真正到人家的那个高度。

2.碱性磷酸酶化学发光

对于AP,其发光原理和吖啶酯完全不同。但不管是哪种底物,其原理可以理解为分成两步:第一步是底物A催化产生中间产物B,中间产物B分解成终产物C产生光信号。

从A到B的过程,所有底物一般都进行的很快,但从B到C,产生光信号的时间,不同的底物差别挺大。就拿AMPPD来说,从A到B特别快,但是从B到C很慢;而APS-5,从B到C能做到非常快,所以发光时间大大缩短。但越快的同时,稳定性可能会受到影响。

我们总结常见的AP底物的发光强度、发光时间和稳定性排序:

发光强度和发光时间:AMPPD<CDP-Star<APS-5

稳定性:APS-5<AMPPD<CDP-Star

所以,在AP的试剂体系中,有以下几个特点:

  • AP与底物需要额外的时间,出结果的时间会长;

  • 底物本身有一定的开发难度和额外成本;

我们在开发的试剂的过程中,也发现AP其实还有其他特点:

  • 偶联标记工艺过程长,可能一次需要2天的时间;

  • 但工艺比AE更加可控(AE偶联虽然简单,但容易受到温度等影响,而且有时候高浓度会有气溶胶污染)。

汇总一下,两个平台的优缺点如下图所示。优缺点都不少,其实没有完美的平台。

很多人说,AE比AP有一点很大的优势,就是出结果的时间短。其实现在也不尽然,正如上面所述,AP搭配APS-5,也可以做到1分钟内的孵育时间,让出结果更快。

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