IVD前沿丨 快速低成本，单核苷酸分辨率，无需预扩增的核酸检测技术

MARVE的关键创新是设计了一种金属离子的双链DNA探针（称为TE探针），它将核酸识别与酶扩增结合起来。TE探针是一个Ag (I)离子结合的双链DNA，包含一个Rec链和一个顺式链（block链），双链退火杂交形成一个C-Ag (I)-C人工碱基（如下图）。具体来说，reverse toehold上的C-Ag (I)-C人工碱基设计为胞嘧啶-胞嘧啶（C：C）错配，可以通过碱基金属阳离子相互作用与金属离子Ag (I)结合。通过链置换过程，病毒RNA与TE探针的结合破坏了C-Ag (I)-C人工碱基对并释放Ag (I)。Ag (I)对脲酶有很强的抑制作用，脲酶催化尿素裂解产生NH4+ 改变了溶液pH；然后用pH指示剂酚红比色表示病毒RNA的存在。将DNA探针、脲酶和颜色指示剂混合物设计在可折叠的测试纸上，病毒RNA可以通过纸折叠过程检测到，结果可以通过肉眼或基于智能手机的检测设备读取。

新的检测方法最好具有以下特点：(1)高特异性来区分病毒RNA中的SNV，能够识别病毒变异；(2)具有多路复用能力，涵盖检测多个关注或感兴趣的变异；(3)与测向流动测试相媲美的便利性和成本效益。

MARVE检测方法描述的无需预扩增比色核酸检测方法满足以下要求：(1)TE探针可以通过核酸链置换反应的编程区分单个核苷酸不同的序列；(2)可折叠纸张作为芯片，可根据需要设计多个检测点进行多路复用；(3)该方法消除了核酸扩增反应，可以像测向流动试验一样读出。总的来说，MARVE检测结合了核酸检测的特异性和横向流动检测的便利性，并为分析不同的病原体提供了一种可编程的多路复用性。

作者演示了在人工咽拭子样本中筛选SARS-CoV-2变异，包括Alpha、Beta、Gamma和Delta。在对50份临床咽拭子样本的检测中使用该检测方法，与RT-qPCR和测序结果100%一致。通过该检测方法检测到的病原体还能被扩展到植物病原真菌、细菌和病毒。应用该方法检测SNV，作者还研究了细菌的抗生素耐药性、真菌的抗真菌素耐药性和肿瘤的耐药性。

此方法具有成本效益，可多路复用，具有单核苷酸精确度，可作为测序的补充工具。此外，通过在溶液中进行检测，该检测方法包括使用酶标仪进行高度多路复用和快速的样品应答测试，使其成为通过快速和高通量病原体定量筛选抗病原体药物和治疗试剂的有效工具。

总的来说，MARVE检测方法简单方便，可在资源有限的情况下的适用性，如家庭、学校和机场。此外，这种智能手机可读的检测方法很便宜（每次检测0.30美元）和快速（30-45 min），使其能够用于SARS-CoV-2变异的人群水平监测。

最近开发的大部分核酸检测方法还没有被设计用于区分病毒变异。此外，也没有平衡精确度、吞吐量、检测时间、成本和可用性，以实现SARS-CoV-2变异的人口水平监测。MARVE与其他核酸检测SARS-CoV-2诊断方法的比较见下表。

下一代测序在识别新出现的变异和大规模监测方面显示出良好的能力，但需要实验室配备体积庞大的设备和专业人员，限制了在实验室外环境中的可用性。基于核酸扩增检测，比如RT-qPCR、等温扩增核酸分析法等方法都需要一个预扩增步骤，从而造成气溶胶污染的风险，可能导至假阳性结果。此外，核酸扩增的参与不可避免地增加了检测时间和成本，以及检测设备的复杂性。无预扩增核酸检测已用于诊断COVID-19，如CRISPR-cas13检测、核酸侧流检测和报告蛋白检测。这些检测方法易于执行、快速和经济有效。然而不能解决病毒基因组中的SNV，不能检测到SARS-CoV-2变异。

相比之下，MARVE可以分辨基因突变，无需核酸扩增，可以多路复用，易于执行。MARVE原则上能够检测到SARS-CoV-2的任何变体。消除预扩增可将检测时间缩短到45 min以下。该检测涉及的试剂，如Ag(I)嵌入的DNA探针和脲酶，都很便宜，成本效益高（每次测试0.30美元）。这些特征使MARVE在SARS-CoV-2变异的人群水平监测中非常有前景。

该方法快速、比RT-qPCR和测序更简单、更经济，但也有一些局限性。首先，尽管能够检测SNV，但不能筛选病毒基因组中的未知突变。因此被认为是流行病监测测序的补充工具。第二，核酸扩增的消除使MARVE的敏感性低于RT-qPCR，存在无法检测到病毒载量很低的感染者的风险。但MARVE的检测限为400个病毒RNA拷贝/μl，足以检测大多数感染。第三，目前，无提取取样依赖于热灭活核酸酶和病毒裂解，需要一个独立的加热装置。第四，该分析涉及纸张折叠步骤。可以探索与基于流体流动控制工具的纸张微流体的集成，以消除纸张折叠过程。最后，在目前的检测版本中，脲酶需要保持在4°C。冷冻干燥有延长脲酶在室温下保存的潜力。