深度解析 illumina测序技术！

一、簇的生成(Cluster Generation)

1、桥式PCR

1）文库结合在芯片上

在Illumina测序平台的流通池(Flow cell)表面，固定了无数条分别与文库接头中P5和P7互补的寡核苷酸链(P5和P7各只有一种，从下到上都为5´→3´方向，用于延伸)。

变性后形成的单链化的文库DNA片段进入流通池后，与P5/P7互补结合(一个双链文库的两条链，一条链为P5结合，另一条链为P7结合，因为固定在芯片上的P5和P7的种类和方向决定)。

因为文库稀释后浓度足够低，可以认为文库片段均匀的结合在流通池表面，每个片段结合的位置相距足够远，从而保证桥式PCR后形成的一个Cluster为单克隆，否则测序时会导至信号叠加而不能识别。

2）第一轮复制，清洗掉模板文库

往芯片加入dNTP和聚合酶。聚合酶会产生一条与文库模板互补的新链。加入NaOH，使DNA解链，冲洗掉没有种在芯片上的模板链。

3）“桥”的形成

加入中性液，稀释中和碱液。因为单链DNA另一端为不同的接头序列，可以与相邻的另一种寡核苷酸互补结合，形成“桥”式结构(假如第一次结合的为P7，则复制完成洗脱模板后顶端可以与相邻的P5互补结合形成“桥”，P7反之)。

4）桥式扩增

往芯片加入dNTP和聚合酶，聚合酶会沿“桥”式结构延伸出一条新链。

加入NaOH，使DNA解链，中和碱液，“桥”式结构再次形成，再次加入dNTP和聚合酶，再次形成新链……。

如此重复，25-28个循环后，原来散布在表面的单核苷酸序列变成散布的DNA簇，这一步主要是为后续测序做准备，因为测序时单分子产生的光信号很弱，难以检测。

2、制备测序单链

1）原理

“桥”式扩增后一个DNA簇都是由最初的一条单链文库模板复制而来，但是这时候P7上的序列与P5上的序列是分别从两端开始的，测序要保证每个片段一致性(都是正向或都是反向)，因此需要再次解链线性化，切割并洗去P7上的DNA链，只留P5上的DNA单链。

这个磷酸基团在接下来的测序过程中，起到了阻止引物链延伸的作用。此后的双末端测序中需要恢复3'-OH，则用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶(AP-endonuclease)这个3´磷酸基团切掉。

2）反应过程

加入NaOH，使所有桥式DNA解链成直链。将反向链与引物的链接切断，并封闭引物3´端避免发生配对。碱液清洗后芯片上只留下共价键连在芯片上的正向链。

二、测序

1、可逆终止子和荧光标记dNTP

四种颜色的荧光基团用叠氮连接到四种相应的碱基上，同时核苷酸3'末端也用一个叠氮基堵住。叠氮基团在遇到巯基试剂(如二巯基丙醇)时，会发生断裂，并在原来的位置留下一个羟基(-OH)，而这个羟基也是碱基原本应有的。

巯基试剂切断叠氮基团的效率极高，这可以保证这个反应可以多次反复地高效地进行，而不影响每步反应的效率。同时，测序用的聚合酶对修饰后的dNTP仍保持较高聚合活性。

2、测序过程

使用中性液中和lane内环境，留下的正向链重新成桥，加入测序引物Read1 SP和修饰过的DNA聚合酶，则在测序引物3´端开始DNA复制。在流通池加入可逆终止荧光dNTP，其3'-OH被阻隔，在除去阻隔前只能添加一个碱基。

Read1结束后，解链并洗掉测序中已经合成的部分，加入测Index的引物，继续在3´端进行延伸测序，读出接头中Index序列，从而可以确定出每个位点的DNA属于哪个文库。

如进行双端测序，洗掉前面复制合成的片段，DNA单链继续在流通池表面形成桥式连接，这时要用AP-endonuclease处理修复P5的3´-OH末端，加入聚合酶，则在P5末端开始DNA复制。复制完成后将P7上的DNA切割并洗掉。

Illumina是通过在P7核酸链中加入一个U碱基，用USER酶来切断DNA链。这时只留下P5上的DNA链，加入测序引物Read2 SP，则可进行另一端的序列读取。

3、测序类型

1）芯片接头差异

4）Index的读取策略

由于Index引入方式不同，i7端的index存在相同和反向互补的情况。由于Illumina不同机型双Index PE测序策略中Index2（i5）的读取方式不同，i5端的Index存在相同和反向互补的情况。

①双Index PE测序(Novaseq,Miseq,Hiseq2500)

②双Index PE测序(Nextseq，Miniseq，Hiseq3000/4000，HiseqX)

参考文献：

［1］《陈巍学基因》illumina测序化学原理

［2］第二代测序原理的详细解析！-微生态与微进化

［3］Illumina Hiseq/Miseq测序原理简介-孙佳瑞

［4］干货 | Index这件小事，你get了吗？-诺唯赞