IVD开发 | 百日咳核酸检测产品

    自20世纪80年代以来，一些百日咳白喉破伤风联合疫苗接种率高的国家陆续发生百日咳流行或局部暴发，被称之为百日咳再现。近年来，我一些省份也陆续出现百日咳疫情大幅回升，引起各方高度关注。国家疾病预防控制局发布的数据显示，2024年2月共报告百日咳17105例，比2023年12月多增7979例，同比增长则近32倍。根据统计数据，今年的前两个月百日咳的发病数已经与去年全年的发病数接近，出现死亡13例，死亡数超过了2018~2023年的总和，推动了核酸检测产品的需求。

    百日咳（Pertussis）是由百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）引起的急性呼吸道传染病，具有高度传染性。其临床特征包括阵发性痉挛性咳嗽，伴有“鸡鸣”样吸气回声，病程可持续数月，因此得名“百日咳”。百日咳主要通过飞沫传播，婴幼儿尤其易感，且病情较成年人严重。百日咳是儿童常见的危重病之一，尤其是婴幼儿，可导至肺炎、脑病、惊厥、营养不良等并发症，甚至死亡。因此，及时准确地诊断百日咳对于防治该病具有重要意义。

细菌培养法：是百日咳的金标准诊断方法，通过从患者的鼻咽部或咽喉部采集分泌物，接种到特殊的培养基上，进行厌氧培养，观察百日咳杆菌的生长和形态。该方法的优点是特异性高，可进行菌株的分型和药敏试验，但缺点是敏感性低，耗时长（需7-10天），受抗生素的影响大，且需要专业的实验室条件和技术人员。

血清学法：是通过检测患者血清中的百日咳杆菌特异性抗体，如IgM、IgG和IgA，来判断是否感染百日咳。该方法的优点是操作简单，快速，不受抗生素的影响，但缺点是特异性低，易与其他呼吸道病原体交叉反应，且需要两份血清样本（急性期和恢复期）进行比较，不能作为早期诊断的依据。

    分子生物学法：是通过检测患者呼吸道标本中的百日咳杆菌特异性核酸，如16S rRNA、IS481、ptxP等，来确定是否感染百日咳。该方法的优点是敏感性高，可在病程的早期进行诊断，不受抗生素的影响，可进行菌株的分子流行病学监测，但缺点是特异性低，易与其他呼吸道病原体或环境中的百日咳杆菌交叉反应，且需要专业的实验室条件和技术人员。

    高灵敏度：能够检测低至1000 copies/mL的百日咳鲍特菌DNA。

高特异性：通过特异性引物和探针设计，避免与其他病原体交叉反应。

    快速检测：从采样到结果报告仅需1.5小时，适用于临床快速诊断。

    适用性广：可用于鼻咽拭子、鼻咽洗液等多种样本类型，新冠之后市场留有大量荧光定量PCR仪器。

    随着百日咳发病率的上升，尤其是在青少年和成年人中，核酸检测产品的需求也在增加。多家企业已推出百日咳核酸检测试剂盒，并获得了国家药品监督管理局的批准，如伯杰医疗、亿立方生物等。

境内注册产品：

来自NMPA和各公司宣传

境外注册产品：

来自FDA和CE相关资料

产品设计

• 双重靶标检测策略：同时检测百日咳杆菌的16S rRNA和IS481基因,避免假阴性或假阳性结果,提高检测准确性。

• 内参基因监控：检测人类β-actin基因,监控标本质量和扩增效率,排除污染或抑制,提高检测可靠性。

• 实时荧光定量PCR技术 ：实时监测核酸扩增,灵敏度高,检测下限可达10拷贝/反应。

• 一站式操作流程 ：标本采集、保存、提取、扩增、检测环节无需复杂前处理,操作简便。

• 广泛适用性 ：适用于各类呼吸道标本(鼻咽拭子、痰液等),婴幼儿及成人患者。

  
  

有效竞争点

• 操作简便：标本的采集、保存、提取、扩增和检测做到一站式的服务，无需复杂的前处理步骤，只需将标本加入到预先配置好的反应液中，即可进行PCR仪器的运行，整个过程控制在2小时内，当然越短越好。

• 准确可靠：采用双重靶标的策略，即同时检测百日咳杆菌的16S rRNA和IS481基因，以避免假阴性或假阳性的结果，提高检测的准确性。采用内参基因的策略，即同时检测人类的β-actin基因，以排除标本的污染或抑制，提高检测的可靠性。

• 灵敏高效：采用实时荧光定量PCR的技术，即在PCR过程中，通过荧光信号的变化，实时监测核酸的扩增情况，以判断是否存在百日咳杆菌的核酸。产品的检测下限做到10个拷贝/反应，即使在低浓度的标本中，也能够敏感地检测出百日咳杆菌的核酸，提高检测的效率。

• 适用广泛：各种类型的呼吸道标本，如鼻咽拭子、咽喉拭子、痰液、支气管灌洗液等，无论是婴幼儿还是成人，都能够方便地进行标本的采集，提高检测的覆盖率

• 方法学优势：与细菌培养法和血清学法进行比较，关注产品的敏感性、特异性和准确度

• 硬核条件：通过国家食品药品监督管理局（NMPA）的注册审批，获得医疗器械注册证。

1. 目标病原体和基因选择

    百日咳（由Bordetella pertussis引起）和类百日咳（由Bordetella parapertussis引起）是主要的目标病原体。

常用的目标基因包括：

• IS481：高拷贝数，存在于B. pertussis和B. holmesii中。

• IS1001：高拷贝数，存在于B. parapertussis和B. bronchiseptica中。

• ptxA-Pr：单拷贝数，存在于B. pertussis、B. parapertussis和B. bronchiseptica中。

• PRN：百日咳毒素基因，特异性较高。

2. 参考引物和探针序列

• IS481引物和探针：

• Forward: CCGAACCGGATTTGAGAAAC

• Reverse: TAGGAAGGTCAATCGGGCAT

• Probe: CCGGCCGGATGAACACCCATAA

• IS1001引物和探针：

• Forward: TGAGGTCGGGCGAATCGTC

• Reverse:TTGTTGGTAAGTTGCAACATCCTGTCC

• Probe: CCGGCCGGATGAACACCCATAA

• ptxA-Pr引物和探针：

• Forward: TTCGTCGTACAAAACCCTCGA

• Reverse: GTTCATGCCGTGTTGGATTG

• Probe: CTTCCGTACATCCC

• PRN引物和探针：

• Forward: TGCCGACTGGAACAACCA

• Reverse: GTCGGAGCCCTGGATATGG

• Probe: ATCGTCAAGACCGGTGAGCGCC

3. 引物浓度优化

    引物浓度的优化是确保PCR反应特异性和效率的关键步骤。初步设置可以根据文献推荐的工作浓度进行，然后通过梯度实验进一步优化。

• 推荐初始浓度：引物的初始浓度通常设置在0.1-0.5 µM之间。

• 优化方法：使用梯度PCR方法，测试不同浓度的引物组合。例如，可以设置一个6×6的矩阵，测试50 nM到800 nM范围内的引物浓度。

• 实验步骤：

• 准备PCR反应混合物，包含固定浓度的模板DNA和dNTPs。

• 设置不同浓度的正向和反向引物。

• 运行PCR反应，并通过凝胶电泳或实时PCR检测扩增产物。

• 选择产生最低Ct值且无非特异性扩增的引物浓度组合。

4. 退火温度优化

    退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素。通过梯度PCR可以确定最佳退火温度。

• 推荐初始温度范围：通常在55-60°C之间。

• 优化方法：使用梯度PCR仪器，设置一系列退火温度。例如，可以设置从50°C到65°C的温度梯度，每隔2°C一个温度点。

• 实验步骤：

• 准备PCR反应混合物，包含固定浓度的引物、模板DNA和dNTPs。

• 设置梯度PCR程序，测试不同的退火温度。

• 运行PCR反应，并通过凝胶电泳或实时PCR检测扩增产物。

• 选择产生最高特异性和产量的退火温度。

5. Mg2+浓度优化

        Mg2+是PCR反应的必需辅因子，其浓度对反应效率和特异性有显著影响。

• 推荐初始浓度范围：1.5-2.0 mM。

• 优化方法：通过逐步增加Mg2+浓度，测试其对PCR反应的影响。例如，可以设置0.5 mM的增量，测试0.5 mM到4.0 mM范围内的Mg2+浓度。

• 实验步骤：

• 准备PCR反应混合物，包含固定浓度的引物、模板DNA和dNTPs。

• 设置不同浓度的Mg2+。

• 运行PCR反应，并通过凝胶电泳或实时PCR检测扩增产物。

• 选择产生最高特异性和产量的Mg2+浓度。

• Hasan MR, Tan R, Al-Rawahi GN, Thomas E, Tilley P. Evaluation of amplification targets for the specific detection of Bordetella pertussis using real-time polymerase chain reaction. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2014 Jul;25(4):217-21. doi: 10.1155/2014/763128. PMID: 25285127; PMCID: PMC4173943.

• 中国疾病预防控制中心. 中国百日咳诊疗与预防指南（2024版）[J]. 中华医学杂志, 2024.

• 中华医学会儿科学分会感染学组, 中华儿科杂志编辑委员会. 中国儿童百日咳诊断及治疗建议[J]. 中华儿科杂志, 2017, 55(8): 568-572.

• American College of Chest Physicians. Clinically Diagnosing Pertussis-Associated Cough in Adults and Children: Chest Guideline and Expert Panel Report[J]. Chest, 2018.

• 国家卫生健康委员会. 百日咳诊疗方案（2023年版）[J]. 国际流行病学传染病学杂志, 2023.

• Finnish Medical Society Duodecim. Treatment of Community-Acquired Pneumonia and Pertussis in Finnish Children: 2015 Guidelines[J]. Finnish Medical Society Duodecim, 2015.

• Centers for Disease Control and Prevention. National Center for Immunization and Respiratory Diseases Division of Bacterial Diseases: 2019[R]. CDC, 2019.

• Centers for Disease Control and Prevention. Final Pertussis Surveillance Report[R]. CDC, 2021.

• 国家药品监督管理局. NMPA官网[EB/OL]. [引用日期2024-05-30].