多重qPCR（multiplex quantitative Polymerase Chain Reaction，mqPCR）则是结合实时定量PCR技术的多重PCR。它在多重PCR的基础上，通过添加特异性引物和探针，并利用荧光信号实时监测PCR过程，从而实现对多个DNA片段的实时定量检测。
通过查阅大量资料发现，多重qPCR探针有多种类型，如TaqMan水解探针、分子信标探针、双重杂交探针、小凹槽结合剂（MGB）探针、Amplifluor检测探针、蝎子探针、LUX探针和QZyme探针等。这些探针各有优势，应用场景也各不相同。而在市面上常见的多重qPCR检测试剂盒中，常用的多重qPCR探针为：TaqMan水解探针和分子信标探针。下面主要针对这8种探针进行简单介绍：
图3 TaqMan水解探针技术路线图 （二）双萃灭探针：
图4 双萃灭荧光探针技术路线图 （三）分子信标探针：
图5 分子信标探针技术路线图 （四）双重杂交探针：
图7 小凹槽结合剂（MGB）探针技术路线图 （六）Amplifluor检测探针：
图8 Amplifluor检测探针技术路线图 （七）蝎子探针：
（八）LUX探针：是用于qPCR的标记探针，用于与目标序列杂交并产生荧光以指示比对。它包含称为LUX™引物的环结构引物。它具有与目标互补的序列和荧光报告基因。这里报告分子发出的荧光被发夹的二级结构淬灭，因此不需要淬灭分子。
（九）肽核酸探针：是一种人工合成的DNA类似物，结构上保留了DNA的碱基和脱氧核糖，只是原本的核糖-磷酸骨架被类似肽键的酰胺键骨架（图中红圈标注）取代。因此，PNA依然遵循碱基互补配对原则，而骨架则由原本的负电性转为近中性，减弱了双链核酸之间的静电斥力作用，使得LNA与DNA或RNA的结合稳定性和特异性均大为提高。而且，PNA的酰胺键骨架不易被核酸酶和蛋白酶水解，使其在体内和体外均极其稳定。
图11 肽核酸探针原理图，来源小桔灯网 （1）PNA探针具有更高的Tm值，相比常规DNA-DNA序列，每增加一个PNA碱基，其Tm值相应提高至少1℃； （2）PNA的电中性骨架，可减少其与DNA和RNA链的静电排斥作用，使得PNA与靶标序列具有更高的亲和力； （3）PNA具有高特异性和高灵敏度，一个碱基对的错配可使 Tm 值明显降低，可用于区分单碱基突变； （4）PNA具有良好的稳定性，在高温或高pH条件下，可稳定存在；且由于没有核酸酶和蛋白酶的识别位点，因此对酶降解的抗性也更强； （5）PNA与靶标序列的杂交结合强度不依赖于盐离子浓度，杂交速率更快，可提高100-5000倍。
（5）LNA具有高核酸酶抗性，在体内和体外均较为稳定，可应用于反义技术。
qPCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。荧光探针为一直线型的寡核苷酸，探针的5′端标记一个报告基团，3′端标记一个淬灭基团。在设计荧光探针时，可以选择标记不同的荧光报告基团和与之搭配的淬灭基团。 多重qPCR的实验设计要求比单一反应体系复杂得多。用于检测不同目标的探针必须携带具有不同光谱范围的荧光基团。下图是几种常见荧光基团的发射光谱。从图中可以看出，虽然许多荧光光谱相似的荧光基团的最大发射波长不同，但在附近的波段内，它们仍然会相互重叠。有必要避免荧光基团的发射光谱之间的相互干扰。
图14 常用的荧光报告基团 因此，在同时选择多个荧光基团时，要注意尽量选择波长差距较大的荧光基团，避免不同荧光通道之间的互相干扰。 值得一提的是，在不同的荧光定量PCR仪中，使用的ROX染料各不相同。ROX是一种惰性参比染料，不参与荧光定量PCR反应，荧光信号值不会随反应而改变。但是由于耗材质量、机器稳定性、照明不均匀、反应体系的浓度等原因造成每个样品孔会有微小的差异，ROX可作为阳性参比，对荧光信号进行归一化校正。因此，在进行荧光定量PCR前，需要了解所用的仪器型号是否需要加入ROX进行光学校正。 不同仪器ROX的选择：
内参基因，也称为管家基因，即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 （一）如何挑选合适的内参基因呢？ 一般要选择在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作为内参基因。理想的内参基因应该满足以下条件： （1）不存在假基因（Pseudo gene），以避免基因组DNA的扩增； （2）表达量不要太高或太低，中等表达量为宜； （3）其稳定的表达水平与目标基因不要相差太大； （4）表达量不受环境、生物或非生物胁迫等实验性措施或内源性因素的影响； （5）在不同类型的细胞和组织中及不同的生长发育阶段都稳定表达，Ct值最好不超过0.5。
图15 常用的内参基因 在进行qPCR实验时，如果研究的实验样本类型有过相关研究论证，可以从已发表的文献或拿到注册证的同类型产品筛选出内参基因；如果没有已知可用的内参基因，可从数据库ICG（http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page）或其他途径选择内参基因并进行筛选论证。 （四）内参基因的筛选与验证一般流程 （1）选择多个候选的内参基因； （2）针对这些基因进行荧光定量PCR； （3）分析这些内参基因的表达稳定性以及变异系数等； （4）确定最优内参基因进行后续实验。 许多研究证实，理想的内参基因并不存在，不同的处理因素以及不同组织中内参基因表达的稳定性是不一致的。因此，在进行内参基因选择时，应根据不同实验条件进行仔细的分析和确证，从而选择合适的内参基因。对于目标基因表达水平要求精确时，传统的单一内参基因存在一定的局限，建议使用两个或多个基因作为内参。 （五）内参基因的分类 内参基因一般分为内源性内参基因和外源性内参基因。 （1）内源性内参基因 是指在每个样品进行提取时便已存在于样品中的RNA或DNA。当采用内源性对照作为阳性对照，通过对信使RNA（mRNA）的均一化定量来消除每次反应中加入的总RNA量的差异。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA等。 优势：与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序。 劣势：不同物种，不同生理状态下，不同组织中的内参基因存在一定的差异。 （2）外源性内参基因 是指在每个样品中加入的具有已知浓度的特殊RNA或DNA。外源性阳性对照通常是来自可以作为内部阳性对照（IPC）的体外成分，可区分真正的目标阴性和PCR抑制。此外，外源性对照还可均一化样品提取或逆转录中互补DNA（cDNA）合成的效率差异。无论是否使用阳性对照，使用含有ROX染料的参比荧光对照都是十分重要的，因为它可以对非PCR相关的荧光信号波动进行均一化。注：添加不会干扰靶序列扩增的人工合成的内参基因，只能用来监测扩增或提取等过程。 优势：能更好的反映监测过程中出现的扩增抑制还是提取问题；
编辑 | 小彭 来源 | 原创 ✦ 关于我们 ✦ |
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