PCR传奇史：“浪”出来的生物技术

PCR的全称是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），简单说就是用人工技术不断复制DNA，让它一变二，二变四，越变越多。自然状态下提取的DNA样本浓度一般都比较低，通常要通过PCR扩增后，才能用于检测、测序、转基因等操作。

PCR实验大家都没少做，但要说到PCR技术的发明过程，知道的人可能不多。而PCR技术发明者的灵感来源，说起来更是让人大跌眼镜。

“浪”出来的PCR技术

1983年，Cetus生物公司的职员凯利·穆利斯和女同事约会的时候磕了些迷幻剂，嗑药后驾车在高速公路飞驰时（危险动作切勿模仿），路边的两排路灯在他眼前幻化作DNA双链，在他眼前不断离合、延伸……穆利斯意识到，他发现了扩增DNA的方法！

穆利斯觉得自己能搞个大新闻，兴冲冲地向公司汇报了自己的想法，领导们都震惊了：“TMD在公司乱搞男女关系、嗑药，还有脸拿出来说？！”

领导们一致决定，先给他降职转岗，如果他不能把他吹嘘的PCR技术发明出来，再让他收拾包裹滚蛋。顺便说一句，穆利斯之前的两份工作分别是自由作家和蛋糕店店员（店老板是他前妻），如果这份工作也丢掉，他真的要吃土了。

在这种情况下，穆利斯还不忘跟公司讨价还价：“我生物底子太烂，能不能派几个技术员来帮我？”

公司领导：“少来了，你不是生物化学博士，还发过Nature吗？”

穆利斯：“可我那篇Nature是关于宇宙学的！”

情景还原：穆利斯在加州大学伯克利分校读博时，过着白天实验室（合成迷幻剂），晚上宿舍（嗑药）两点一线的生活。一次他嗑药磕嗨，在幻觉中看到了宇宙大爆炸，他醒来后把那个解释大爆炸宇宙学的理论草草写下来投给Nature，竟然真发表了。学校见他发了Nature，便给了他一个博士学位（博士迟迟不能毕业的生物狗切勿模仿，否则后果自负）。

公司领导一听，好家伙，嗑药都能发Nature，难道他这次嗑药出现的幻觉也大有价值？于是一下子给他派了三个技术员，帮他研发PCR技术。1984年11月，这些技术员们完成了第一次PCR实验，对一个49 bp 的DNA片段进行了10个PCR循环的复制扩增。

“酶”女相助

生物狗都知道，PCR循环主要分三步：变性，退火，延伸。先用高温让DNA双螺旋结构变性，使两条互补链分开变成单链；然后降低温度，让引物与单链DNA结合；最后， DNA聚合酶跟在引物后面，给单链DNA合成另一条互补的链，DNA的复制就完成了。

穆利斯的PCR技术最初用的DNA聚合酶是使用大肠杆菌DNA聚合酶，但这种酶不耐高温，一高温就失活了。所以，技术员要在每一个PCR循环的退火阶段及时加入聚合酶，让它进行DNA复制，然后到了下一个循环，这些聚合酶在高温变性阶段全部失活，只能在高温后加入新的聚合酶。这样不但麻烦（否则穆利斯也不会需要这么多人手），而且成本非常高（生物狗都知道酶有多贵）。

穆利斯也觉得这样不行，提出要换一种耐高温的DNA聚合酶，在高温状态也不会失活，这样整个PCR过程只需要加一次酶就够了。

那有没有这样的耐高温酶呢？还真有！美国的黄石国家公园有个大棱镜温泉（又叫大虹彩温泉），它是美国最大、世界第三大的温泉，水温高达85℃。这个温泉的特异之处是，水面从里向外呈现出蓝、绿、黄、橙、橘、红等各种颜色，像棱镜折射出来的太阳光一样五彩缤纷。

热气腾腾的大棱镜温泉

这些像玛丽苏头发一样的彩虹色，其实是嗜热菌的颜色。这个温泉里生活着大量的嗜热菌，它们在85℃以上的高温也能生存，而且体内含有各种色素，使温泉呈现出各种颜色。

1973年，台湾女生钱嘉韵赴美留学，她在辛辛那提大学生物系读研期间，从大棱镜温泉的嗜热菌中提取了耐高温的DNA聚合酶。但当时PCR技术尚未发明，所以这种耐高温DNA聚合酶也没有用武之地。钱嘉韵的这个研究，只发了篇研究论文便宣告结束。

但这篇论文却成了穆利斯的灵感之光。1986年，他按照钱嘉韵论文描述的方法，只花了三个星期就成功提纯了耐高温DNA聚合酶，把它用于PCR，效果好得惊人。这种聚合酶不但大大简化了PCR工作，同时专一性及活性都比之前使用的酶更强。

Cetus公司高兴地把穆利斯推荐给诺奖得主詹姆斯·沃森（DNA双螺旋结构发现者之一），沃森一见穆利斯，顿感惊才艳绝，邀请他参加冷泉港实验室的“人类分子生物学”会议，报告PCR的原理及实际应用结果。这是穆里斯生平第一次受邀演讲，而且参会的都是学术界的大牛。

“机”友加盟

现在的PCR操作非常简单，往管子里加样完毕，扔PCR仪里跑上几十个循环，就可以拿出来愉快地跑胶验证了。在PCR仪跑循环的一两个小时里，勤快的生物狗可以做点其他实验，偷懒的就会摸鱼看个电影玩个游戏什么的。

但穆利斯当时还没有PCR仪，所以当时他做实验的画风是这样的：分别将三个水浴温度恒定在三个温度：高温变性温度、退火温度、延伸温度，然后把一个装着PCR管的小篮子，放进高温变性水浴槽里泡着，十几秒钟后估计变性得差不多了，然后把篮子放退火水浴槽里泡几秒钟，再放延伸水浴槽里几十秒。反应一个循环，就要把篮子在三个水浴锅依次泡过。几十个循环下来，技术员的手都抖得跟帕金森一样。

为了减少这些生物民工的劳动量，Cetus公司在1988年发明了第一台PCR自动化热循环仪 ，PCR技术实现了自动化，同时一票PCR技术员也随之失业……

有了耐高温DNA聚合酶和PCR仪这两大法宝，PCR技术得到了很好的运用。1989年，Science杂志隆重报道了PCR技术和耐高温DNA聚合酶，Cetus公司也和罗氏公司合作，将PCR技术用于临床诊断。1991年，罗氏药厂以三亿美元买下了Cetus公司的PCR技术专利。那可是九十年代初的三亿美元！

然而，这笔巨款没有穆利斯的份儿，因为在1985年PCR技术初见成果的时候，Cetus公司催穆利斯赶紧把这技术写论文投稿，但穆利斯沉迷电脑游戏迟迟懒得动笔，公司为了赶时间，让技术员先写了篇论文投Science，等重度拖延症患者穆利斯终于写好论文想投稿时，关于PCR的论文已经不新鲜了。穆利斯表示被公司其他人抢了功劳很不爽，参加完沃森的“人类分子生物学”会议后不久就辞职离开。

穆利斯辞职时，只拿了一万美元和五个月薪水，日后PCR技术的巨额利润，都没他什么事了。他后来辗转在几家生物公司工作，靠着“PCR发明者”的名头，也能混碗饭吃。

他就这样一直浪着，还迷上了冲浪，在1993年的一个清晨，他冲浪回来被一群记者包围，他才知道，他凭PCR技术获得了诺贝尔奖！

穆利斯一下子C位出道，名利双收，变得更浪了，他嗨皮地娶了第四任老婆，还写了一本名叫《心灵裸舞》的自传，一听就知道不是什么正经书……

虽然PCR发明故事如此狗血，但这项技术确实极大地推动了生物学的进步。所以说，只要你能做出诺奖级的成果，你也可以随便浪（但是不能嗑药）！

正说版

现在让我们回到1953年，双螺旋发现的那一年。那年Kary Mullis 8岁，正是和小伙伴们漫山遍野瞎跑的年纪。在他出生的1944年，薛定谔出版了《生命是什么》。当然了，8岁的他既看不懂这部生物学著作，也完全理解不了DNA结构的发现到底意味着什么。事实上很长一段时间里，他都对生物学毫无兴趣。

Kary Mullis

比起生物，Mullis反倒在化学领域上显得颇有天赋。十几岁的时候，他就从家里偷来糖，混上药店里买来的硝酸钾，和小伙伴们自制火箭；在乔治亚理工学院修习化学学位期间，他也常常自己合成有毒物质和爆炸物。很幸运，几乎没人管他，那段时光让Mullis掌握了不少有机化学知识。

所以到底为什么他选择了生物化学作为接下来的研究方向呢？Mullis自述只对小分子感兴趣，而PCR出现之前的DNA又长又“稳如泰山”，和他喜欢的化学合成完全搭不上边。修完硕士修博士，在加州大学伯克利分校读了六年生物化学，到1972年毕业，Mullis依旧是只懂化学，不懂生物。

好在他的导师Joe Neilands很宽容，他并不限制学生选课程，所以Mullis赫然选修了一门天体物理学。神奇的是这门课他可能学得不错，甚至在1968年时发表了一篇名为《十年逆转的宇宙学意义》的论文，发在《自然》上。多亏了这篇论文，要不然他恐怕拿不到博士学位。

Mullis此时应该没想到自己日后的成就

毕业后，Mullis没有想好要做什么，于是就先随着妻子来到堪萨斯州。起初他想当个作家（执念很深，后来确实出书了），但是遗憾的是毫无天赋。随后他在医院工作了一段时间，又因为离婚回了伯克利，做了两年餐馆的经理人。

这里要提到一位好朋友Tomas White，是这位朋友劝说他回到学校继续深造，也是White介绍他到Cetus工作，后来又在Mullis难以立足的时候拉了他一把。

Mullis来到加州大学旧金山分校，进行药物化学的博士后研究。学习期间，他了解到，DNA也可以通过化学方法来合成。Mullis对此产生了兴趣。1979年，他来到Cetus的时候，也是负责合成寡核苷酸，给公司其他部门的同事使用。

Mullis确实在化学合成上有天赋，他很快搞出了计算机自动合成程序，工作流程大大简化。1981年，他就当上了实验室的负责人。

128号公路

1983年春天的一个夜晚，Mullis载着当时同在Cetus工作的女友从旧金山前往乡下度过周末。汽车行驶在蜿蜒盘旋的128号公路上，此时一个念头出现在Mullis的脑海中——扩增DNA片段时，如果同时添加两条引物，分别扩增正义链和反义链，那么只要引物足够，岂不是可以无限循环地扩增下去！

Mullis马上靠边停车，掏出纸笔开始演算。这种扩增方法，每个循环得到的DNA都是上一循环的二倍，那么循环10次DNA就能扩增1000倍，循环个30次就能达到10亿倍！

这个数字太惊人了，这个思路也太简洁了，Mullis一时之间都无法相信，之前居然从未有人尝试过。他反复查阅资料之后，在Cetus内部的科研会议上分享了自己的想法。然而奇怪的是，同事们完全不觉这有什么厉害之处。

Mullis花了几个月时间寻求认同，但赞同他观点的科学家寥寥无几，这期间他与女友的感情也出现了裂缝，直到9月，他才开始第一次实验。

如果顺利，DNA将不断以倍数扩增

在诺奖致辞中，Mullis提到他不喜欢重复劳动，如果一件事需要反复做同一个流程，那么他会倾向于写个程序来解决。所以那个夜晚，他把聚合酶加入试管后就径直回家了，满心以为DNA已经在管中自己成倍增加了。

然而第二天中午，Mullis没能在凝胶中看到期望的条带。他不得不承认，反复地加热、冷却、添加聚合酶，这枯燥的工作是绕不过去的坎儿。

接下来的三个月里，Mullis磨磨蹭蹭地进行着实验，同时为了感情问题焦头烂额。终于在飘雪的圣诞节，他终于成功实现了扩增一个pBR322质粒的一个25bp长的片段，同时也失去了爱情。

结束的开始

事情进展并不顺利。1984年中，Mullis再次在Cetus的会议上向同事汇报了自己的成果，结果依旧无人感兴趣。也是在这个会上，Mullis和另外一位同事发生了口角，上升到了肢体冲突。这个突发事件以Mullis降职、另一人离开公司结束。

Mullis的好友White此时已经当上了Cetus的技术副总裁，他帮助Mullis拉起一支小组专门研究PCR，其中有个名为才木的日本人。不知是不是日本人天性严谨又勤劳，这支小组成立后，研究很快得到了推进，他们成功扩增了一个110bp的人源蛋白基因片段。

进行了更多的尝试之后，研究者们决定撰写两篇论文，Mullis主导的一篇介绍PCR技术理论，才木主导的另一篇介绍PCR技术的应用。

出于某些原因——笔者本人相信可能是Mullis的拖延癌又犯了——当才木的论文写好时，Mullis几乎还没动笔。

在前几节我们提过，此时Cetus正把全力投在IL-2开发上，公司急于从科研公司转型到制药公司，没有时间耗费在不知能不能变现的技术上。高层没法等Mullis完成论文，便催促才木赶快先把应用论文发表。

12月，才木的论文发表在了《科学》上，题目是《β-珠蛋白基因组序列的酶促扩增和限制性位点分析诊断镰状细胞贫血》。

Mullis的论文就没那么好运了，他先后投了《自然》和《科学》，都因为内容不够“原创”被拒稿，最后不得已投了《酶学方法》，论文直到1987年才出版[14]。

同一年里，Cetus内另一组科学家也在为PCR的进化添砖加瓦。PCR最初的版本使用的是来自大肠杆菌的DNA聚合酶，这种酶不耐热，必须每个循环都重新添加，大大降低了自动化程度。

Cetus与Perkin-Elmer合作开发的热循环仪原型机，因为需要持续添加DNA聚合酶，所以采用了敞口、机械臂移动的方式

从耐热菌中分离聚合酶的想法是谁提出的不确定，最后进行这项工作的是David Gelfand和Susanna Stoffel。两位科学家在秋天从Thermus aquaticus中分离到了能够在95℃高温下依旧不失活的TaqDNA聚合酶，Taq酶马上就被应用到了PCR中。

这就是我们现在也在使用的PCR第一次完整出现。

1986年的热循环仪原型机

幻觉中的情圣

看起来PCR已经走过最艰难的时刻，是该享受光辉和荣耀的时候了。然而不知为什么，共过苦的伙伴，却很难同甘。

一方面，是PCR发明人的身份争议；另一方面，Cetus对PCR团队也着实不太公平，虽然Mullis获得了一万美元的奖金，但是团队里的其他人只是象征性地收到了一美元，这让他们与其他团队之间的分歧更大了。1986年，Mullis选择了离开Cetus。

1991年，Cetus折戟梦途；1992年，身价3亿美金的PCR专利去往新东家Hofmann-La Roche；1993年，Mullis登上诺贝尔领奖台，大谈童年时光与128号公路上的那个夜晚。

Mullis与PCR的故事其实到这里就差不多已经全部说完了。纵观他的一生，Mullis表现出很多并不那么像个德高望重的诺奖获得者的特征。

Mullis在诺贝尔获奖致辞中反复提到分手的女友，甚至表示获奖的喜悦也抵消不了失去这个姑娘的悲伤——就算那已经是十年前的事情了——表现得像个痴心的情圣，可他50岁前就结了四次婚。据称他在男女关系上确实不那么保守，也曾因此在公司内引发问题。

White把Mullis描述为一个充满创造力，但是有些过于随心所欲的角色[16]。Mullis才华横溢，而且没有对权威的畏惧，但是另一方面他并不那么自律，实验进行得断断续续，这是他无法在Cetus内部取信于人的原因之一。他俩的友谊最后没能持续下去，但在之后的舆论纷争中White一直站在Mullis的一边。

Mullis还有些不那么登得上台面的小爱好。1938年，Albert Hofmann首次合成了LSD，这种物质在十年后被引入精神疾病治疗领域，然后在短短几年时间内成了倍受年轻人喜爱的时髦小玩意儿，成为史上最有名的致幻剂[17]。Mullis上学的时候也好这一口——这是他亲口告诉Hofmann的——并且Mullis认为LSD带来的幻觉帮助他在128号公路上找到了PCR的灵感。

Mullis还有些甚至不太像科学家的地方。比如他认为HIV病毒并非AIDS的病因、全球变暖是个伪命题；他相信占星术，相信转世，还宣称自己曾与伪装成荧光浣熊的外星人对话。

还有一个有趣的细节。前文曾讲过，Kleppe1971年发在《分子生物学杂志》上的论文首次提到了修补复制的概念，也提到了双引物系统。

人类学家Paul Rainbow曾写过一本书“Making PCR：a story of biotechnology”，详细地讲了整个PCR的发现故事，书中提到，其实1969年的高登会议上，Kleppe就公开发表过这个观点，当时在场的科学家中有一位名为Stuart Linn。

巧了，这位科学家正是Mullis就读加州大学伯克利分校期间的一位老师，而Linn也的的确确曾在课堂上演示过Kleppe的设想，实验也成功了。所以Rainbow认为，Mullis可能只是个“追随者”，并非“开创者”。

Mullis是个“好人”吗？我们不知道。但是PCR，真真实实地改变了世界。