常见磁珠选择，包被过程应该注意哪些？

根据官能团的不同，磁珠类型自然非常的多样，羧基磁珠、甲丙酰胺基磁珠、链霉亲和素磁珠，其中常用的像酶促化学发光就用到的羧基磁珠比较多，而像罗氏电化学发光用的链霉亲和素磁珠更多。链霉亲和素磁珠通常是以三组分的形式，生物素标记抗体、磁珠、发光物标记抗体构成试剂盒，相比于其他类型反应更缓和。磁珠的直径是非常重要的参数，磁珠直径越小能够结合的抗体越多，很好地增大抗体结合的表面积。提高抗原抗体结合效率。

1、羧基磁珠

表面羧基化大概是最常见的纳米材料表面修饰方法了。通过在磁珠表面修饰羧基，能够增加磁珠表面的亲水性，提高磁珠在水溶液中的稳定性，同时还能够有效降低磁珠表面的非特异性吸附。羧基表面修饰工艺较为简单，而且应用广泛，几乎每个磁珠厂家都会推出羧基表面修饰的磁珠。羧基磁珠表面修饰有丰富的羧基基团，能够在特殊化学试剂的作用下将蛋白质、核酸、多肽等偶联到磁珠表面，在蛋白纯化、免疫检测、分子检测、NGS、细胞分离等领域应用广泛。

在化学发光免疫分析中磁珠作为反应载体，其上包被特异性抗原或抗体，捕获待测物中的靶标分子。蛋白质可以通过吸附作用与羧基修饰颗粒结合，吸附是由蛋白质和颗粒表面之间的疏水和离子相互作用介导的，吸附作用发生非常迅速。除了被吸附外，蛋白质还可以共价连接到羧基修饰的颗粒表面。羧基可以被水溶性碳二亚胺激活，与被吸附蛋白质的自由氨基反应形成酰胺键。此处讲到的主要有疏水作用力和共价连接。在羧基磁珠包被过程中常用的缓冲体系是Tris体系。

羧基磁珠包被抗体蛋白的方法一般是通过EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）活化法。EDC是一种水溶性的小分子，无需有机溶剂助溶，同时反应过程中的异脲副产物也是水溶性的，通过水洗或透析就可以方便的去除。通过EDC活化后的羧基可以和抗体的氨基形成稳定的酰胺键，从而将抗体固定在磁珠表面，这种反应通常在偏酸性环境下完成。

EDC活化羧基偶联蛋白的方法有两种，一种是一步法，先后将抗体、EDC加入至羧基磁珠溶液中，EDC边活化羧基，同时与抗体氨基反应。这种反应简单便捷可控，但是EDC过量容易导至抗体聚集体的发生，影响活性，并且EDC活化羧基后的活化酯中间体与氨基反应的速度较慢，且极易水解，因此反应效率往往较低。

另一种是采用两步法，将EDC活化羧基的反应，以及与蛋白氨基形成酰胺键的反应分为两个步骤。这种方法通常需要在第一步活化羧基过程中引入Sulfo-NHS活化酯。Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺酯）是一种能够快速和氨基反应的亲水小分子。EDC活化羧基后，与Sulfo-NHS形成稳定的中间体，去除掉多余的EDC后，再加入抗体蛋白，蛋白上的氨基再与NHS中间体反应形成酰胺键。采用两步法能够有效避免EDC残留导至抗体蛋白的聚集，同时Sulfo-NHS的引入能够有效提高酰胺键形成的效率，有的研究表明，引入Sulfo-NHS的两步偶联法，蛋白偶联效率是单独采用EDC的20倍。此外，Sulfo-NHS的磺酸基能够在羧基活化后，能够在微球表面形成负电荷层，维持微球表面的稳定性，防止磁珠聚集。

2、Tosyl甲苯磺酰基磁珠

甲苯磺酰基是化学发光免疫检测当中应用最为广泛的一种磁珠表面。甲苯磺酰基不需要活化剂预先活化，在特定的溶液中就能够与抗体产生共价结合。反应可控性强，非特异性吸附低，包被过程的重现性好，因此在批量制备磁珠的时候，批间控制更好。

市场上生产甲苯磺酰基的品牌厂家主要有Dynabeads，以及JSR，Merck也推出了甲苯磺酰基修饰的磁珠。由于甲苯磺酰基的表面修饰工艺更为复杂，因此鲜有国内磁珠厂家优先开发这类磁珠。

因涂层中含有甲苯磺酰基所以无需羧合剂，含有氨基的抗体等分子以化学结合的方式固定在磁珠表面。随着化学结合的进行，甲苯磺酰基会逐渐脱离，粒子表面亲水性增强，从而维持磁珠表面偶联物生物活性，并可有效抑制分析时的非特异性反应。

在pH为7.0至8.0的缓冲体系内，甲苯磺酰基与蛋白上的巯基反应。当反应缓冲pH调节至8.5至9.5时，与蛋白上的氨基反应。

一般偶联抗体过程中，采用100mM的硼酸缓冲液作为偶联过程中的反应溶液。先将磁珠用硼酸缓冲液清洗两到三次，最后用超声充分将磁珠分散重悬，加入抗体蛋白。通常，甲苯磺酰基的包被过程中的浓度较羧基的高，一般采用30mg/mL的磁珠浓度进行偶联包被。磁珠蛋白混匀后，将反应管放在设置好的37°C恒温摇床中过夜反应（12-18小时），抗体与甲苯磺酰基即可完成反应。如果降低反应稳定，反应时间则需要进一步延长。此后，即可用含有0.5%BSA，pH7.4的PB缓冲液对磁珠进行封闭。在37°C条件下，只需要封闭1小时即可，也可在4°C条件下过夜反应。包被过程结束后，可以采用工作缓冲液作为磁珠的保存液，通常保存浓度为10mg/mL。

3、链霉亲和素磁珠

链霉亲和素是一种四聚体糖蛋白，每一个亚基可以结合一个生物素小分子。二者之间的结合是已知的最强非共价结合之一。一般的，可以采用共价偶联的方式，将链霉亲和素包被在磁珠表面，再将抗体蛋白生物素化，通过生物素-链霉亲和素之间的特异性结合，将抗体连接至磁珠表面。这种方式免疫检测磁珠具有一定通用性，只用一款磁珠，即可完成所有检测。罗氏诊断几乎所有化学发光项目都采用生物素-链霉亲和素的方式完成检测。

链酶亲和素磁性微球可以轻松和生物素化的生物大分子结合，实现探针的制备，或者生物大分子的分离。链酶亲和素磁珠偶联C反应蛋白(CRP)单克隆抗体并用于免疫层析试纸条。磁珠偶联链霉亲和素能从样品中对生物素标记的分子进行高纯度的特异性吸收。因磁珠表面亲水性聚合物涂层不会影响酶促反应进行，在PCR反应体系中混入磁珠也不会对核酸扩增产生影响。在酶免测定中，还可作为生物素标记抗体的载体进行使用。

4、包被经验

常用的磁珠包被抗体比例是20μg/mg，磁珠母液浓度是10mg/mL，通常稀释的工作液是中性缓冲液，1:50稀释，工作液终浓度0.2mg/mL，磁珠包被过程中可能会出现聚集现象。此时就要考虑磁珠与抗体处理工艺，或者抗体本身原料存在问题，大部分项目是不会有聚集，而磁珠包被抗原的项目会出现聚集项目。此时就要筛选缓冲体系，或者对原料进行纯化处理，像透析等。

信息来源：生物医学知识局，体外诊断IVD知识库