长读长、无需扩增、单分子实时测序，是SMRT测序和纳米孔测序共有的特征。但后者似乎更新潮，也更符合人们对未来测序技术的想象。 不同于SMRT技术，其只是跳出了链末端终止法的框架，纳米孔测序几乎完全摒弃了旧的“话语体系”——它从光的语言（荧光检测），转变成了电的语言（电信号检测）。我在前一篇文章里提到，可以想象测序仪中存在一双眼睛，由它来阅读由A、T、C、G四个字符写成的基因组之书。在纳米孔测序仪中，纳米孔就像是那样的一双眼睛。所谓的纳米孔，指的是纳米尺寸的孔状结构。和零模波导孔ZMW不同，它是两端贯通的孔洞。可以是生物纳米孔，也可以是固态纳米孔，或者是将蛋白质孔集成到固态膜上的混合纳米孔。纳米孔测序的头号公司Oxford Nanopore Technologies（以下简称ONT）的第一代技术采用的是α-溶血素一类的蛋白质纳米孔，内径为1 nm，与单个DNA分子的尺寸相当。此类纳米孔在细胞膜上天然地存在，作为离子或分子进出细胞的通道。未来则可能使用氮化硅、石墨烯等材料的固态纳米孔。 
这些纳米孔分布在一层高电阻率的聚合物膜上。膜的两侧是两个充满电解液的腔室。由于核苷酸分子本身带有负电荷，它们会从阴极一侧，流向阳极一侧，从而穿过纳米孔。当DNA/RNA链从纳米孔中穿过时，纳米孔也在“阅读”这条链。链上的每个核苷酸在占据纳米孔的那一刻，对离子电流产生阻断效应。而由于不同的核苷酸在尺寸、空间结构上存在差异，相应地，在通过纳米孔时产生的离子电流的变化是不一样的。也就是说，每种核苷酸都有其特征性的电流变化，如同独一无二的指纹。因此，实时监测并记录某条DNA/RNA链通过纳米孔的电流变化图谱，可以回溯、推断出核苷酸顺序，从而实现单分子测序。如上图所示，纳米孔测序过程犹如穿针引线。就像线离不开针的固定和导引，核苷酸链从纳米孔中step-wise地、逐步地穿过时，离不开相关蛋白质和酶的辅助和控制。其中最关键的可能是分子马达（Molecular Motor），或称马达蛋白（Motor Protein）（图中的黄色斑点）。它具有解旋酶活性，使DNA双链或DNA-RNA杂交链解离为单链，牵引单链穿过纳米孔，还能调控穿过时的速度。核苷酸链在纳米孔中逐个穿过的过程被称作易位（Translocation），步骤很简单：先导接头、模板链、发夹接头、互补链、尾部接头依序通过。其中发夹接头把两条链接续起来，允许模板链和互补链的连续测序，相当于把一条序列测了两遍，是纳米孔测序中的2D读取模式。1D模式下则采用普通的接头（为了提高通量而牺牲一部分准确率）。也许就是因为采取了电信号检测而不是荧光检测方式，纳米孔测序仪可以做得比常规测序仪更小巧、便捷。2014年4月，ONT公司向一部分抢先体验的用户推出了世界上首款纳米孔测序仪，MinION，并在2015年将其商业化。这台测序仪就如同它的名字一样迷你，仅手掌大小，重量在90 g左右。用于信号检测的膜片钳放大器被压缩、集成到了专用集成电路（Application-Specific Integrated Circuit, ASIC）上。所以它比一部手机大不了多少。这也让纳米孔测序仪更具有未来感。试想一下，当测序仪变得像耳温枪、血糖仪一样小巧、便宜，家家户户都可以备一台，那岂不是很方便？孕妇不必去医院做无创产前检测（检测胎儿是否患有染色体非整倍性检测，如21-三体综合征），自己扎一针，用测序仪对含有胎儿游离DNA（cffDNA）的血液测个序就行了。癌症则可以对血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）测序。尽管现在听起来有点天方夜谭，但我们不应缺乏想象。当世界上首台计算机问世时，那个30吨的大家伙对于普通人来说遥不可及。而现在遍地是电脑，人人手持一部手机。突出的便携性，以及即时性（测序速度很快），使之与POCT（Point-of-Care Testing）的调性很搭。它非常适用于一些需要现场即时分析的场合。例如，MinION测序仪曾被带去非洲西部，对埃博拉病毒患者进行测序。埃博拉病毒的确认仅需15分钟的仪器运行时间。NASA曾在微重力条件下对MinION进行试验，并将其带去国际空间站。因为MinION足够地小，在失重条件下也容易控制。小型化是测序仪发展的必然趋势，但前提是无损于测序性能。独特的基于电信号检测的测序方式和异于普通测序仪的便捷性，使纳米孔测序技术被寄予厚望。这种“厚望”可能还比人们对SMRT技术的期望更“厚”一些。甚至还出现了一个说法，将纳米孔测序与SMRT测序区分开来，单独归在“第四代测序技术”一类。纳米孔测序的长读长优势更显著，在长读长模式下为10-100 kb，超长读长测序模式下则达到100-300 kb，最高记录为2.3 Mb。但它的测序准确率一般低于SMRT测序。稍微想想，就能知道高准确率的纳米孔测序实现起来有多么困难。核苷酸链在纳米孔中的易位速度极快，电流变化极难捕捉，必须千万次地优化纳米孔的设计与修饰以及马达蛋白，减缓易位速度，才能得到可辨认的电信号谱图。而不同核苷酸产生的离子电流变化又是极其微小，如何根据这种微小的变化将它们区分开来，也是一大难题。可以说，纳米孔测序更特别，与NGS的距离更远。研究人员们通常将其与NGS结合使用，利用其在长读长上的优势，拓宽基因分析与生物学研究的边界。目前，对于不同的测序技术，一个普遍的共识是：没有最好的测序技术，只有最适合的技术。对于纳米孔测序，想象中的美好未来还没有来，但值得期待。[1]https://nanoporetech.com/platform/technology[2]Jain, M., Olsen, H.E., Paten, B. et al. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomic community. Genome Biol 17, 239 (2016).[3]MacKenzie, M., Argyropoulos, C. An introduction to nanopore sequencing: past, present and future. Micromachines 2023, 14(459). | 
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