高错误率常被认为是三代测序技术的主要特征之一。不够准确的长读长测序，就像锋利而命中率不高的飞镖，破空而去，却射不中目标，不免令人失望。 然而近几年，情况似乎发生了变化。三代测序准确率有了明显的提升。它在科研界似乎从幕后走向台前，应用实例变多了，受到的关注也日渐增多。这其中发生了什么？ > HiFi测序的诞生：一遍读不准，那就多读几遍咯 HiFi测序由PacBio公司开发，意思是High-Fidelity（高保真）测序。你可以认为是SMRT测序技术的进阶版。它兼具长读长和高准确率，也是目前正在推广和应用的、最具代表性的版本。 准确率之所以提升，主要是因为它采取了一种被称作Circular Consensus Sequencing (CCS)的测序模式。有人将CCS翻译为“环化共有序列”，听起来很唬人，但如果把两个词拆开来理解可就容易多了。 首先是Circular。在HiFi测序流程中，样品先被打断为一定长度的双链DNA分子（>10 kb）后，然后其两端被接上发卡结构的接头序列（Hairpin adapters）。两条链接续起来，构成哑铃形状，如下图所示。把它展开以后就是一个由DNA正链、反链和接头序列组成的环状分子。由此构建的文库叫做SMRTbell Library。
与Illumina和其他二代测序技术相似，SMRT测序过程是边合成边测序（Sequencing by synthesis），也就是说，以待测DNA为模板进行DNA复制，在合成新链的同时，通过检测新捕捉的核苷酸来确定DNA序列。HiFi测序的模板就是上述带有发卡接头的、环化了的DNA分子。由于两条链已经连接起来，DNA复制过程不存在断点，聚合酶能够在这个环状模板上跑完一遍又一遍，进行周而复始的滚环复制。这是CCS测序模式得以实现的基础。
SMRT测序技术本身的准确率不高，DNA聚合酶在环状模板上跑一次测得的序列准确率通常在90%以下。但由于测序错误的产生是随机的，这种错误可以用一个极其简单直接的方法来矫正，那就是：多跑几遍。 就好像是你有一群不聪明但很认真的孩子，你无法直接阅读一本书，而只能通过他们来间接获取关于这本书的信息。他们会向你逐字逐句地转述书的内容，但每个人都可能随机地在10-15%的字词上出错。 于是，通过比对、得到一致性序列，可以得到高准确率的测序结果。相当于让这些孩子围坐在一起讨论，所达成的共识（Consensus）部分，就可以认为是准确的。因为所有孩子在同一字词上犯错的概率极小。 如下图所示，当你有5个“孩子”，能够实现Q20（99%）以上的准确率，而当你有10个“孩子”，即在环状模板上跑10次（10 passes），准确率就能达到Q30（99.9%）。
听起来简单粗暴、量大管饱，但实现起来没那么容易。前文所说的，发卡接头将两条链接续起来后DNA连续复制是理想状况，实际上，导至DNA复制过程的中断另有其他因素，比如样品DNA本身。DNA的损伤会让聚合酶在复制中途脱落，从而使测序过程中断。因此，CCS测序模式非常依赖于样品DNA质量。需要预先筛选出高质量DNA分子，最大程度地减少受损DNA的比例，才能有效地实现高准确率测序。 另外，pass次数不可能是无限的，测序准确率的提升也是有天花板的。在环状模板上周而复始地复制，对于DNA聚合酶来说是连轴转的苦力活。它很容易就过劳死了，不可能在那个环上工作到天荒地老。 > 纳米孔测序的进阶：工欲善其事，必先利其器 与PacBio HiFi测序的“电梯直达”式的进阶之路不同，ONT提高纳米孔测序准确率的道路要显得曲折一些，更像是阶梯式的螺旋上升。 在发展纳米孔测序技术的早期阶段，ONT也曾采取与CCS相似的方法。他们也在样品DNA上连接发卡接头，只不过是其中的一端，而不是两端。这样将两条链串联起来以后，马达蛋白先牵引模板链通过纳米孔，发卡接头和另一条互补链紧随其后，从而一次完成两条链的测序，相当于对一条序列正着测又反着测，测了两次，因此ONT称之为2D模式。读取的序列则被称作2D read。对某种特定的纳米孔而言，例如ONT的R9.4纳米孔，2D模式下的测序准确率从原先1D模式下的86%提升到94%。 继2D模式后，ONT于2017年推出了1D2测序方法。他们为DNA分子的两条链分别接上一种特殊的接头，该接头大概率能使互补链和模板链被同一个纳米孔所捕获，但不能确保这一事件的发生（概率>60%）。
但由于两种测序技术在测序原理和过程上存在本质的不同，CCS策略在PacBio的SMRT测序中一路高歌的盛况，却在纳米孔测序中难以复现。纳米孔测序为边解旋边测序（不是边合成边测序），一经解旋便无法恢复，所以是一过性的，不支持反复跑、反复测。另外，核苷酸链一旦通过纳米孔，以目前的技术，应该是没法让同一条链反向再次通过同一纳米孔。所以HiFi测序中5个pass、10个pass对于Nanopore测序来说几乎不可能实现。 对纳米孔测序而言，纳米孔本身与马达蛋白的优化，可能才是属于它的康庄大道。 ONT从未停止过改进纳米孔和马达蛋白的步伐。2014年的R7纳米孔测序准确率仅为64%左右，而2016年推出的R9纳米孔一下子把准确率提升至～87%。根据ONT官网提供的数据，R10.4.1在特定的测序条件下，可以达到99.9%以上的准确率。 事实上，获取共有序列（Consensus sequence），即对同一序列的多个拷贝进行测序，或者对同一序列多次测序，是消除随机误差的常见方法。采取此方法的测序准确率也被称作Consensus accuracy。除了HiFi测序的CCS模式以外，还可以通过扩增样品DNA、提高测序深度、算法矫正等方式来提高准确率。ONT纳米孔测序的最新版本R10.4.1，其Consensus accuracy据说可以达到99.999%（10-20x测序深度）。 在2021年发表于Nature Methods上的一篇文章中，作者将一种早已用在单细胞转录组测序研究中的独特分子标志符（Unique molecular identifier, UMI）与三代测序技术结合。UMI是一串随机的寡核苷酸序列，每一条UMI都独一无一。它被嵌入到模板DNA时，则成为一种分子标签。可以认为它是DNA分子的“身份证”。通过识别这串随机字符，能够识别扩增后的DNA分子来源于哪一条模板DNA。考虑到三代测序错误率高的特点，作者采取了特殊的UMI设计，并通过数据过滤，有效地提高了UMI识别能力，从而把ONT纳米孔测序的错误率降低到了0.0042%（R10.3），把PacBio的HiFi测序错误率降低到了0.0007%。 不过，在测序前先对模板DNA进行扩增的做法，似乎没有让三代测序技术发挥它单分子测序的优势。现在的三代测序技术稳中求进，但好像缺乏一种颠覆性的创新，或者一股磅礴的能量，让它彻底沸腾起来。否则仅有长读长这一项优势，相关的数据处理软件也尚未成熟，它将很难超越或者替代二代测序。 至于技术，从来都没有什么秘密，无非是千万次地优化，不断地改进罢了。
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